Visualisatie van de poortwachter: Evan's op blauwe kleurstof gebaseerde beoordeling van de doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière bij volwassen zebravissen

Dit onderzoek richt zich op het ontwikkelen van een betrouwbare, eenvoudige en kosteneffectieve methode om de integriteit van de bloed-hersenbarrière bij volwassen zebravissen te beoordelen. De meeste zebravisstudies hebben geen gemakkelijke, betrouwbare manier om verstoring van de bloed-hersenbarrière te meten, en bestaande methoden zijn vaak complex of duur. Dit protocol biedt dus een praktische en betaalbare oplossing.

Dit protocol is eenvoudig, kosteneffectief en combineert zowel visuele als meetbare analyse, allemaal zonder dat er dure apparatuur of ingewikkelde stappen nodig zijn. Door een eenvoudig, reproduceerbaar protocol te bieden, wordt het voor laboratoria gemakkelijker om neurovasculaire veranderingen in volwassen zebravisziektemodellen te onderzoeken. Verdoof om te beginnen de zebravis door de watertemperatuur geleidelijk te verlagen van 12 graden Celsius naar zeven graden Celsius totdat de vis niet meer reageert op tactiele prikkels.

Injecteer met een insulinespuit van 31 gauge 20 microliter 1%Evans blue, of EB-kleurstof, in de intraperitoneale holte van de vis en oefen gedurende 10 seconden lichte druk uit op de injectieplaats om terugstroming te voorkomen. Breng de vis nu over naar een vuilwatertank en laat hem 30 minuten herstellen. Houd de vissen gedurende deze tijd in de gaten op verwondingen, sterfte of gedragsveranderingen.

Om een positieve controle tot stand te brengen, bereidt u een steriele naald van 31 gauge voor die aan een insulinespuit is bevestigd om een procedure voor steekwondletsel uit te voeren. Verdoof de vissen na een herstelperiode van 30 minuten opnieuw, zoals eerder aangetoond. Zet de vis rechtop op een vlakke, koude ondergrond, zoals een ijsgelpack.

Steek de naald in een hoek van 90 graden in één kant van het cephalon tot een diepte van niet meer dan 1,5 millimeter. Breng de vis vervolgens over naar een vuilwatertank en laat hem 30 minuten herstellen. Na het euthanaseren van de vis door onderkoeling, gebruik een steriel mes of een chirurgische schaar om de geëuthanaseerde vis te onthoofden.

Spoel de kop twee keer af in 1X PBS met een verhouding van 1:20 van vis tot PBS om overtollig bloed en Evans blauwe kleurstof te verwijderen. Fixeer vervolgens de kop in 4% paraformaldehyde met een verhouding van 1:20 van vis tot fixeermiddel en broed een nacht bij vier graden Celsius. Plaats de vaste kop in een schoon petrischaaltje en ontleed de hersenen met een pincet met een puntig uiteinde.

Voeg PBS tijdens dissectie continu druppelsgewijs toe om het weefsel gehydrateerd te houden en uitdroging te voorkomen. Spoel de ontlede hersenen twee keer in twee afzonderlijke PBS-baden en plaats het weefsel op een 1%agaroseplaat om vocht vast te houden en krimp te voorkomen. Bekijk het ontlede hersenweefsel onder een stereomicroscoop.

Om te beginnen met kwantitatieve analyse, downloadt en installeert u Fiji-software en opent u het hersenbeeldbestand in Fiji. Voer kleurdeconvolutie uit door Afbeelding te selecteren, gevolgd door Kleur, Kleurdeconvolutie en kies RGB. Dit resulteert in drie afzonderlijke afbeeldingen die rode, groene en blauwe tinten vertegenwoordigen.

Activeer nu de afbeelding met het blauwe kanaal, meestal aangeduid met kleur 3, door op de afbeelding te klikken. Converteer het naar 8-bits grijstinten door Afbeelding te selecteren, gevolgd door Type en 8-bits. Als u vervolgens de grijsintensiteit van de 8-bits afbeelding wilt meten, stelt u de meetparameters in door Analyseren en Metingen instellen te selecteren.

Kies vervolgens de grijswaarde voor het gebied en de gemiddelde. Teken met het gereedschap voor het selecteren van rechthoeken een interessegebied van uniforme grootte en meet de grijsintensiteit door Analyseren te selecteren, gevolgd door Meten. Normale zebravissen vertoonden een typische bruinachtige huidskleur en de EB-geïnjecteerde zebravis vertoonde een opvallende blauwachtige tint.

Om de integriteit van de bloed-hersenbarrière in het Parkinson-model van de volwassen zebravis te onderzoeken, werd de extravasatie van EB-kleurstof in hersenweefsels vergeleken tussen met zoutoplossing geïnjecteerde controlegroep en Parkinson-zebravis. In de negatieve controlegroep leken de bloedvaten in de hersenen roodachtig, wat wijst op de afwezigheid van extravasatie van EB-kleurstof. Daarentegen vertoonden de met zoutoplossing geïnjecteerde controle-, positieve controle- en Parkinson-groepen allemaal blauwachtige kleuring in het vaatstelsel van de hersenen, wat de succesvolle systemische circulatie van EB-kleurstof bevestigt.

Ontlede hersenen uit de negatieve controlegroep leken witachtig met duidelijk zichtbare bloedvaten, wat de afwezigheid van EB-kleuring bevestigde. In de groep met positief controleletsel duidde een intense blauwe kleur rond het hersenweefsel op kleurstoflekkage als gevolg van opzettelijke verstoring van de bloed-hersenbarrière. In de groep met zoutoplossing bleef de EB-kleuring beperkt tot de bloedvaten, wat wijst op een intacte bloed-hersenbarrière.

De Parkinson-groep vertoonde een donkerder, meer diffuus blauw kleuringspatroon, wat wijst op significante EB-kleurstoflekkage en compromittering van de bloed-hersenbarrière. Kwantitatieve grijswaardenanalyse onthulde significant lagere grijsintensiteitswaarden in de Parkinson-groep in vergelijking met de met zoutoplossing geïnjecteerde groep.