Nauwkeurige faagmutagenese met NgTET-geassisteerde CRISPR-Cas-systemen

We bestuderen faaginfecties op moleculair niveau. Dit is echt fundamentele wetenschap. We doen echter niet alleen aan de fundamentele wetenschap, we willen deze fundamentele wetenschap ook vertalen naar toepassingen waarbij we deze kennis gebruiken om de faaginfectie te bestuderen, en om dit te gebruiken voor faagengineering en voor therapeutische toepassingen.

Een van de meest recente ontwikkelingen op het gebied van faagonderzoek is de ontdekking van een bacterieel immuunsysteem. Dit immuunsysteem is aanwezig in alle bacteriën en ze hebben hulpmiddelen geïdentificeerd of gegenereerd om de faag echt te bestrijden. Faag is echter heel slim.

Een faag was ook in staat om gereedschappen te identificeren en hulpmiddelen te ontwikkelen waarmee hij aan dat immuunsysteem kon ontsnappen. En één hulpmiddel is eigenlijk de modificatie van zijn DNA door modificatie. En dit is vooral voor ons, echt interessant, want het bestuderen van de chemische aard van deze DNA-modificaties die fagen hebben gegenereerd om aan het immuunsysteem te ontsnappen, is echt interessant, en stelt ons ook in staat om een hulpmiddel te worden om de faag aan het einde te ontwikkelen.

In de afgelopen 10 jaar zijn er prachtige technologieën ontwikkeld door geweldige collega's over de hele wereld. Een van deze technologieën is bijvoorbeeld next generation sequencing. Op basis van deze technologie kunnen we fagen echt sequencen, maar ook het hele gastheergenoom op moleculair niveau.

Aan de andere kant werd massaspectrometrie, zoiets als proteomics, ontwikkeld. CRISPR is een prachtig hulpmiddel dat nu in verschillende koninkrijken van het leven wordt toegepast. En we gebruiken dit nu ook om het faaggenoom te ontwikkelen.

Dit zijn slechts enkele prachtige technologieën die de manier waarop we tegenwoordig over fagen denken een nieuwe vorm hebben gegeven. Als we het hebben over de huidige uitdagingen, is een van de uitdagingen die we zien de engineering bio CRISPR van een faaggenoom. Het faaggenoom is volledig gemodificeerd met DNA-modificaties en de CRISPR-nucleaire ACE's zijn eigenlijk niet in staat om het DNA te splitsen.

Dit is dus echt een uitdaging die we moeten overwinnen als we het genoom van bacteriële fagen willen manipuleren. Mijn groep heeft een totaal nieuwe bouwsteen van RNA's ontdekt. We ontdekten dat specifieke transcripten zich gedragen op hun vijf belangrijkste eindpunten, het zogenaamde redoxspook, nicotinamide adenine dinucleotide korte NAD, en we ontdekten dit ook onlangs voor het eerst in E-coli T4 faaginteracties.

Op basis van deze ontdekking hebben we ook vastgesteld dat RNA's en eiwitten op een totaal nieuwe manier met elkaar kunnen interageren. We ontdekten dat deze NAD die ik eerder beschreef, werkt als een molecuullijm om RNA's en eiwitten met elkaar te verbinden. Deze RNA-verheerlijking is een totaal nieuwe manier van hoe RNA's en eiwitten in de natuur met elkaar omgaan.

En we hebben deze ontdekking gedaan in de interactie met eco-antifagen. We willen deze fundamentele wetenschap nu ook vertalen naar toepassingen, bijvoorbeeld op het gebied van op RNA gebaseerde therapieën. Behandel om te beginnen 500 microliter faagsuspensie met 20 eenheden DNA 1.

Voeg twee microliter RNAs AT1 gemengd toe aan de buis. Incubeer het behandelde mengsel gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Laad vervolgens 500 microliter van de behandelde faagoplossing op een voorbereide sucrosegradiënt.

Centrifugeer de gradiënt bij 70.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Steek de centrifugatiebuis vanaf de onderkant aan om de troebele faagband in het verloop te visualiseren. Verwijder vervolgens met een stompe canule voorzichtig de faaghoudende fractie in een nieuwe ultra-ultracentrifugatiebuis.

Voeg nu 30 milliliter ijskoude TM-buffer toe aan de buis en centrifugeer. Resuspendeer de pellet vervolgens in 500 microliter TM-buffer nadat u het supernatant hebt weggegooid. Bewaar de geresuspendeerde fagen een nacht in een glazen injectieflacon bij vier graden Celsius.

Voeg één microgram proteïnase K toe aan de geresuspendeerde fagen. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens een gelijk volume fenolchloroform, isoamylalcoholmengsel toe aan het monster.

Keer om om goed te mengen en centrifugeer. Breng de waterige fase over naar een nieuwe reactiebuis en herhaal de extractie drie keer. Voer drie chloroform-back-extracties uit met een gelijk volume chloroform om het resterende fenol te verwijderen.

Precipiteer vervolgens het DNA door 0,1 volume driemolair natriumacetaat bij PH 5,5 en 2,5 volumes ethanol toe te voegen. Incubeer het mengsel een nacht bij min 20 graden Celsius. Centrifugeer het monster de volgende dag gedurende een uur bij 15.000 G bij vier graden Celsius om het DNA te pelleteren.

Was de DNA-pellet twee keer met 200 microliter 70% ethanol. Schud de buis voorzichtig en centrifugeer opnieuw. Verwijder voorzichtig het supernatant.

Resus, suspendeer vervolgens het gezuiverde DNA in ultrapuur water. Bewaar het DNA bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik. Inoculeer Escherichia coli BL 21D 3-cellen die zijn getransformeerd met zowel het PET 28 NGTet-plasmide als een CAS 12- of CAS 9-expressieplasmide.

Kweek de teelt in LB-medium met aangevuld met geschikte antibiotica bij 37 graden Celsius met schudden. Induceer NG TED-expressie door 0,05 millimolair IPTG toe te voegen en incubeer nog twee uur bij 37 graden Celsius. Vergelijk als controle E.coli BL 21 D3-stammen met en zonder NgTET-overexpressie.

Breng 300 microliter van de E.coli-culturen over in een steriele buis. Infecteer de cultuur met T4 wildtype of met NgTET behandelde faag bij een infectieveelvoud van 0,01. Meng voorzichtig om een gelijkmatige faagverdeling te garanderen en broed dan opnieuw.

Voeg het mengsel van de bacteriefaag toe aan vier milliliter LB zachte vijzel met 0,75% vijzel en antibiotica. Meng grondig, maar voorzichtig om luchtbelvorming te voorkomen. Giet het zachte vijzelmengsel op een voorwarme LB vijzelplaat.

Laat de plaat kort stollen bij kamertemperatuur en broed een nacht bij 37 graden Celsius. Tel de volgende dag de plaques om het aantal plaquevormende eenheden te bepalen. Infecteer voor tegenselectie E.coli cast 13 A spacer met behulp van de fagen die moeten worden tegengeselecteerd.

Voer de tellerselectie uit onder dezelfde omstandigheden als voor mutagenese. Filter na incubatie de SUP-natant door een filter van 0,45 micrometer om bacterieel vuil te verwijderen. Gebruik de door de teller geselecteerde en gefilterde fagen voor een plaque-assay op een E.coli B-stam om individuele plaques te isoleren voor stroomafwaartse validatie.

De faagband was duidelijk zichtbaar wanneer het T4-faagmonster voldoende geconcentreerd was. Expressie van NgTET-eiwit in E.coli werd bevestigd door SDS-faag die de aanwezigheid ervan aantoonde in zowel oplosbare als onoplosbare fracties na cellyse en centrifugatie. Chromatogrammen toonden aan dat de relatieve hoeveelheden dioxiadenosine, diiodohydroxychinoline en thymidine onveranderd waren tussen wildtype en met NgTET behandeld T4-faag-DNA.

De overvloed aan gemodificeerde cytosinederivaten was significant verminderd in het met NgTET behandelde faag-DNA in vergelijking met het onbehandelde monster. Een plasmide met het NgTET-gen en homologieregio's voor gerichte mutagenese werd geconstrueerd met behulp van golden gate-klonen. PCR-screening bevestigde succesvolle amplificatie van het doelgen merrie in de banen twee tot en met negen van de agros-gel, wat wijst op positieve treffers onder de geplukte plaques.

In wild type T4 faag-DNA was de relatieve overvloed aan 5 glycosylhydroxyethyl 2 prime deoxidine hoog. In met NgTET behandeld T4-faag-DNA waren de niveaus van 5 glycosylhydroxyethyl 2 prime-deoxidine sterk verlaagd in vergelijking met het wildtype. T4-faag-DNA behandeld met de katalytisch inactieve mutant NgTET D234 A behield hoge niveaus van 5 glycolhydroxyethyl 2 prime deoxidine.

Herstelde T 4-faagnakomelingen vertoonden bijna herstelde niveaus van 5 hydroxymethyl 2 prime deoxidine in vergelijking met het wildtype.