Meten van eencelveroudering met een beeldvormingsgebaseerde biomarker van chromatine en epigenetische veroudering

We ontwikkelden beeldvormingsgebaseerde chromatine en epigenetisch leeftijdsbeeld, een nieuwe techniek die veroudering en verjonging bij enkelcelresolutie kwantificeert. DNA-methyleringsklokken schatten de biologische leeftijd, maar zijn afhankelijk van lineaire regressie, hebben grote cohorten nodig en vernietigen monsters, waardoor ze kostbaar en ongeschikt zijn voor grootschalige of longitudinale studies. Om te beginnen doe je de bevroren organen en weefsels over in een voorgekoelde vijzel die je boven droogijs plaatst.

Giet vloeibare stikstof over het bevroren weefsel en maal het grondig met een voorgekoelde stamper totdat een gelijkmatig fijn poeder is verkregen. Met een voorgekoelde metalen spatel verdeel je het gemalen weefsel in meerdere buizen. Na het extraheren van de kernen meng je ze met trypanblauw in een gelijke verhouding in een aparte buis.

Breng 10 microliter van het mengsel over naar een hemocytometer, of laad het in een geautomatiseerde celteller. Voer alle metadata, inclusief monster-ID's, condities en biomarkers in en verifieer deze in de plaatkaart en exporteer een CSV-bestand. Doseer nu 10.000 kernen per put in een volume van 20 tot 30 microliter in een plaat met 384 putjes.

Centrifugeer de plaat op 1000g, met versnelling op negen en vertraging op vier, gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Vervolgens fixeer je de kernen door een gelijk volume van 8% paraformaldehyde en PBS toe te voegen, en breng je 10 minuten uit bij kamertemperatuur. Voeg na het verwijderen van het fixatiemiddel 30 microliter 0,1 molaire glycine toe aan PBS en laat het vijf minuten op kamertemperatuur incuberen.

Verwijder de glycineoplossing en was de putten twee keer met 100 microliter PBS. Verwijder de PBS uit elke put en voeg 30 microliter blokkende oplossing toe met 2% BSA en 0,5% Triton X-100 in PBS. Incubeer de plaat een uur op kamertemperatuur.

Na het verwijderen van de blokkerende oplossing incubeer je het monster met 25 microliter primaire antistofoplossing bij vier graden Celsius. Vervolgens was je de putten drie keer met 100 microliter PBS, waarbij elke was drie minuten duurt op kamertemperatuur. Voeg 25 microliter secundaire antistofoplossing toe en incubeer twee uur bij vier graden Celsius.

Daarna spoel je de putten drie keer met 100 microliter PBS, waarbij elke was drie minuten duurt op kamertemperatuur. Kleur de kernen met DAPI of Hoechst door 30 microliter van de kleurstof toe te voegen met een concentratie van 0,01 milligram per milliliter, en was de plaat één keer met 100 microliter PBS om overtollige kleurstof te verwijderen. Download de workflow-scripts uit de GitHub-repository.

Zodra de download voltooid is, pak je het bestand uit om de inhoud eruit te pakken. Organiseer de gekloonde afbeeldingsrepository zodat de mapstructuur overeenkomt met het formaat dat door de workflow wordt aangenomen voor correcte scriptuitvoering. Open vervolgens de Terminal-applicatie als je op Linux of Mac OS werkt, of de WSL-applicatie als je Windows gebruikt.

Verander de werkmap naar de gekloonde repositorymap door het vereiste commando in de terminal in te typen en Enter in te drukken. Maak een nieuwe computationele omgeving genaamd Image_workflow met Conda met Python versie 3.10 en druk op Enter. Activeer de nieuw aangemaakte Conda-omgeving met het commando conda activate Image_workflow.

Installeer Poetry, een Python-pakketbeheerder, binnen de geactiveerde omgeving met behulp van de PIP-installatie. Installeer vervolgens alle vereiste Python-pakketten die nodig zijn voor de workflow met Poetry. Configureer nu CUDA binnen de Conda-omgeving om grafische verwerkingseenheidfunctionaliteit tijdens de segmentatiestap in te schakelen.

Open de Terminal-applicatie en verander de map naar de gekloneerde. Activeer de Conda-omgeving door het onderstaande commando in te typen en op Enter te drukken. Open het hoofdbestand van de workflow in een code- of teksteditor zoals VS Code of Notepad om de analyseparameters te configureren.

Stel de projectnaam in door de variabele p toe te wijzen aan een korte bestandssysteem-safe identifier die wordt gebruikt om uitvoer te organiseren. Stel de lijst van kanalen voor feature-extractie in chs in, inclusief het segmentatiekanaal als features uit dat kanaal nodig zijn. Met ImageIndex en het kanaallabel als sleutel, koppel je de afbeeldingskanaalidentificatie van bestandsnamen aan de eerder opgeslagen hoofdletterplaatkolomkop met een hoofdlettergevoel.

Stel vervolgens datalocaties in door orgDataLoadPath toe te wijzen aan de datasetroute, orgDataSubfolder aan de afbeeldingsubmap indien nodig, en resultsSavePath aan de outputroute. Bevestig de bestandsnaamextensie in imageFileFormat. Bewerk vervolgens imageFileRegEx om Python-benoemde capture-groepen te gebruiken voor de benodigde onderdelen, waaronder rij, kolom, veld, Z-positie en kanaal.

Stel nu het segmentatiekanaal in segmentation_ch in op het nucleaire kanaal dat wordt gebruikt voor objectdetectie. Bepaal of je verlichtingscorrectie gebruikt door een illumiCorrection in te stellen en op waar te zetten om basismodellen te berekenen en toe te passen. Stel vervolgens de fysieke voxelgrootte in micrometers in voxel_dim als ZYX in met behulp van microscoopmetadata.

Sla het bestand op en sluit de editor na het controleren van elke parameter. Voer tenslotte het workflow-script uit om afbeeldingsuitlezingen te verkrijgen en validatie uit te voeren, waarbij de terminal open blijft terwijl het script draait. Visualiseer resultaten en exporteer ruwe beelduitlezingen voor aanvullende analyse in externe software.

Representatieve beelden van geïnduceerde pluripotente stamcellen toonden duidelijk gescheiden kernen gekleurd met DAPI, trimethylated histon H3 bij lysine 27 en geacetyleerd histon H3 bij lysine 27. Beeldanalyse van lever- en skeletspieren toonde een significant verschil tussen jonge en oude monsters, waarbij oude OSKM-muizen een verminderd beeld vertoonden ten opzichte van oude, wat wijst op gedeeltelijke herprogrammering. Analyse van individuele dieren toonde aan dat sommige oude OSKM-monsters aanzienlijk verminderde beeldwaarden vertoonden vergeleken met oude muizen.

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om leeftijdsgebonden veranderingen in chromatine en epigenetische organisatie te onderzoeken met een enkele celresolutie over verschillende celtypen en verschillende weefsels. Onze beeldvormingsmethode is niet-destructief, behoudt de chromatinestructuur, maakt herhaalde metingen mogelijk, en is kosteneffectiever in grootschalige of longitudinale studies. Toekomstig onderzoek zal zich richten op het toevoegen van meer epigenetische markers en het bestuderen van verouderingsgerelateerde, intranucleaire structuren.