Generatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide vlakke haardragende huidorganoïden met behulp van een lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem
17 oktober 2025
Dit protocol schetst een methode voor het produceren van huidorganoïden die haarzakjes bevatten van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een vlak, fysiologisch relevant lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem om de huidarchitectuur en -functie na te bootsen.
De reikwijdte van mijn onderzoek is om een UVB-geïnduceerd schademodel te ontwikkelen zodat ik de pathogeniciteit van een zeldzame ziekte, xeroderma pigmentosum, of preciezer gezegd, XPA, kan bestuderen. Een van de uitdagingen van deze in vitro-modellen is dat het behoorlijk lang duurt om te kweken, ongeveer vier maanden, en omdat het nog een vrij jong vakgebied is, moeten we ze nog wat beter karakteriseren. De voordelen van dit model, zoals het hiPSC-afgeleide 3D-model, de cultuur van de lucht-vloeistofinterface, recapituleren de menselijke huidarchitectuur en hebben een huidaanhangsel zoals talgklier en haarzakjes.
Bereid eerst een oplossing van één molar door natriumhydroxidepellets toe te voegen aan een lege buis van 15 milliliter. Voeg gedestilleerd water toe aan de pellets en laat de buis vortexen om de pellets op te lossen. Filter 0,1 molaire natriumhydroxideoplossing met een membraanfilter van 0,2 micrometer poriegrootte.
Verdun collageen type I oplossing op ijs met 10 keer PBS, vijf millimolaire natriumhydroxide en gedestilleerd water om het uiteindelijke volume aan te passen. Verdeel 150 microliter van deze collageenoplossing in elke insert, geplaatst in een standaard plaat met 12 putjes. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten zodat de collageengel kan polymeriseren.
Vervolgens snijd je P1000-punten af met een verwarmde scalpel om brede looppunten te maken. Gebruik vervolgens de brede openingspunten om een geselecteerde cystische structuur met een kleine hoeveelheid medium op het deksel van een 10 centimeter grote petrischaal te plaatsen. Verwijder zorgvuldig alle bijproducten van de structuur met een steriel scalpel, terwijl je deze stabiliseert met steriele tangen aan de andere kant.
Verwijder ongeveer één millimeter van beide uiteinden van een cystisch huidorganoïde naast de eerste incisie met een scalpel. Vouw voorzichtig de bovenste huidlaag met een steriele tang open. Snijd het weefsel in twee tot vier stukken, afhankelijk van de grootte.
Vervolgens plaats je met steriele tang elk stuk op een collageenbedekte inzetplaat met de epidermis naar boven gericht. Voeg 600 microliter OMM toe aan elke put van een standaard 12-put plaat. Breng de insert terug naar de 12-well plaat met OMM.
Plaats vervolgens de plaat in een incubator van 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Een enkele, dichte cellulaire aggregaat die het merendeel van de cellen bevat, werd gevormd op dag nul door zorgvuldig hanteren en centrifugeren. Een juiste inductie van de oppervlakte-epiderm leidde tot een dun, helder epitheel dat zich op de buitenste laag van het aggregate tegen dag drie vormde. Op dag 12 had zich een dunne laag mesenchymale cellen opgehoopt op één pool van de cyste.
Haarplacodes en pinnetjes werden zichtbaar tussen dag 50 en 80, na epitheel- en mesenchymale co-inductie. Organoïden zonder zichtbare placoden vertoonden extreem dun epitheel en werden uitgesloten van de vlakke overgang. Alleen cysten van minstens vijf millimeter diameter met gepolariseerde bijproducten werden geselecteerd voor de generatie van organoïden van de planaire huid.
Haarzakjes verlengden zich geleidelijk gedurende de 27 dagen van lucht-vloeistof interfacecultuur. Talgklieren werden zichtbaar rond dag 14 in de vlakke configuratie. De pigmentatie in de organoïden nam geleidelijk toe in de loop van de tijd.
Hematoxyline- en eozinkleuring toonde een gelaagd epitheel en een basale membraan die het van de dermis scheidden. Immunofluorescentiekleuring bevestigde een huidachtige structuur van de mens in planaire huidorganoïden.
Overzicht
Deze studie ontwikkelt een UVB-geïnduceerd schademodel om xeroderma pigmentosum te onderzoeken, met de focus op de generatie van huidorganoïden die haarfollikels bevatten, afgeleid van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen. De organoïden worden gekweekt met gebruik van een fysiologisch relevante lucht-vloeistofinterface om de architectuur en functie van de menselijke huid effectief na te bootsen.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Onderzoeksgebied
- Pathogeniciteit van xeroderma pigmentosum
- Ontwikkeling van in vitro huidmodellen
- Gebruik van driedimensionale organoïdtechnologie
Achtergrond
- Uitdagingen bij het kweken van huidorganoïden
- Huidige kennis over de biologie van de huid
- Het belang van haarfollikels en huidbijstucturen in onderzoek
Gebruikte methoden
- Lucht-vloeistofgrenskweek voor organoïde-ontwikkeling
- Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen als bron
- Immunofluorescentie- en histologische kleuringstechnieken
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle generatie van huidorganoïden met haarfollikels
- Observatie van epidermale en mesenchymale co-inductie
- Validatie van een menselijke huidachtige architectuur via kleuring
Conclusies
- Deze studie biedt inzicht in de ontwikkeling van huid-organoïden uit stamcellen.
- Demonstreert het potentieel van het gebruik van dit model voor het begrijpen van huidaandoeningen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Menselijke iPSC-afgeleide planaire haarhoudende huid-organoïden, gekweekt op het lucht-vloeistofgrensvlak, bieden een fysiologisch relevant in vitro-systeem voor het onderzoeken van de huidbiologie en de vorming van huidappendages. Dit platform maakt predictieve modellering mogelijk van weefselreacties op omgevingsfactoren en farmacologische agentia, wat translationeel onderzoek en mechanistische risicoreductie in dermatologisch R&D ondersteunt. Deze benadering vergroot het vertrouwen in de portfolio door robuuste, reproduceerbare huidmodellen mogelijk te maken voor vroege ontdekking en preklinische evaluatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het onderzoeken van intercellulaire interacties binnen een menselijke huidmicro-omgeving mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door het modelleren van aanhangselontwikkeling en weefselstratificatie.
- Faciliteert functionele targetvalidatie voor huidgerelateerde pathways en mechanismen van zeldzame ziekten.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar platform voor kwantitatieve beoordeling van medicatieresponsen en weefselschade.
- Levert gevalideerde biologische systemen met haarzakjes en talgklieren voor de evaluatie van verbindingen.
- Maakt schaalbaarheid van assays en hergebruik van het platform mogelijk voor diverse toepassingen binnen huidonderzoek.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Modelleert weefselresponsen die relevant zijn voor ziekten, waaronder UVB-geïnduceerde schade en infecties door pathogenen.
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën via moleculaire en histologische analyse.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door de brug te slaan tussen ontdekking en preklinische validatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit organoïdesysteem integreert processen van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor hypothesetoetsing, verduidelijking van signaalpaden en voorspellende analyses voor de biologie van de huid mogelijk worden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurde studies naar huidarchitectuur en de vorming van huiduitstelels.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assays naar medicijn- en schaderespons.
- Analytiek: Maakt moleculaire en histologische read-outs mogelijk voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert continuïteit van in vitro modellering naar preklinische ziektestudies.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor meerdere huidonderzoeks- en screeningsinitiatieven.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit in huidonderzoek.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare workflows voor de generatie van organoïden.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door robuuste in vitro-modellering mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en bevordering van dermatologische activa.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, organoïde-manipulatie en weefseltechnologie.
- Vraagt toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor lucht-vloeistofinterfacekweek en moleculaire analyse.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams van kwalitatieve beoordelingspunten en selectiecriteria.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende ziektemodellen of weefseltypen, afhankelijk van de onderzoeksfocus.
- Lange kweekduur en voortdurende karakterisering van het veld zijn praktische beperkingen om rekening mee te houden.
