In vitro Resident geheugen CD8 T-celdifferentiatie met behulp van het epitheliale organoïde-T-cel co-cultuursysteem

Ons onderzoek onderzoekt CD8-resident memory T-cellen in het vrouwelijke voortplantingskanaal, waarbij wordt onderzocht hoe infecties en ziekten hun verblijf, functie, onderhoud en therapeutisch potentieel beïnvloeden. Bestaande methoden beperken de overleving en fenotypische stabiliteit van residente geheugen T-cellen. Dit protocol maakt schaalbare in vitro studie mogelijk door weefselresidentie te induceren via organoïde T-celcultuskweek.

Om te beginnen, plat vaginale epitelorganoïden of VEO's met een dichtheid van 10.000 cellen in 20 microliter basale membraan per put van een 24-put plaat. Plaats het bord in de broedmachine en bewaar de culturen zeven tot tien dagen op 37 graden Celsius. Eén dag voor co-kweek aspiratief het celkweekmedium uit de aangewezen putten en was de putten met DPBS.

Aspireer de DPBS en doe vervolgens 600 microliter voorverwarmde 0,25% trypsine EDTA in de put. Met een BSA-gecoate P1000-pipet, wordt de volledige suspension gebruikt om het basementmembraanextract mechanisch te verstoren en de inhoud van de put over te brengen in een BSA-gecoate steriele 15 milliliter conische buis. Plaats nu de kegelvormige buis in een waterbad van 37 graden Celsius.

Voeg na vijf minuten 10 milliliter van 10% FBS aan RPMI toe om de trypsinisatie te dempen. Plaats vervolgens de buis in de centrifuge en draai vijf minuten op 500 G bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Met een BSA-gecoate pipettip wordt de pellet opnieuw opgehangen in 100 tot 300 microliter T-cel organoïde kweekmedium of gewone DMEMF 12.

Tel de cellen met een hemocytometer. Bereken het benodigde virusvolume om een multipliciteit van 0,1 infectie te bereiken met behulp van het totale celaantal en de bekende virale titer. Aspiraat het celkweekmedium uit de VEE-putten die geselecteerd zijn voor infectie.

Was elke put met 500 microliter voorverwarmde DPBS en plaats de plaat vijf minuten in een broedmachine bij 37 graden Celsius. Na vijf minuten laat je de DPBS weg. Voeg 500 microliter organoïde media toe met voldoende virale deeltjes om een multipliciteit van infectie van 0,1 te bereiken.

Plaats het bord een uur lang in een broedmachine van 37 graden Celsius met 5% kooldioxide, en draai het bord voorzichtig met de hand elke 20 tot 30 minuten. Breng de juiste hoeveelheid basalmembraanextract over die nodig is voor het plateren van min 80 graden Celsius opslag naar vier graden Celsius en laat het acht uur ontdooien. Controleer de VEVO's onder een lichtmicroscoop om de grootte en algehele gezondheid te beoordelen.

Bevestig dat de VEVO's ongeveer 100 micrometer in diameter zijn, met een uniforme ronde morfologie en minimale enkele cellen. Aspireer het celkweekmedium uit de VEE-putten en was elke put met 500 microliter koude, steriele DPBS, gehouden op twee tot acht graden Celsius. Voeg na het verwijderen van de DPBS 200 tot 500 microliter koude organoïde oogstoplossing toe aan elke put, waarbij je minimaal een 10x volume hebt ten opzichte van de basale membraanextractdruppel.

Vervolgens verstoor je met een BSA-gecoate P200-pipet mechanisch het basalmembraanextract. Plaats nu de plaat op een orbitale shaker die is ingesteld op ongeveer 100 omwentelingen per minuut bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Na de incubatie gebruik je een BSA-gecoate pipettip om de inhoud van elke put te mengen en over te brengen in een BSA-gecoate steriele 15 milliliter conische buis.

Plaats de buis in de centrifuge en draai vijf minuten op 500 G bij vier graden Celsius. Gooi daarna het supernatant weg. Was de VEE-pellet met vijf tot tien milliliter koude DPBS en centrifugeer het opnieuw op 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Aspireer de DPBS, gebruik vervolgens een P1000-pipetpunt, sussief de pellet opnieuw in één milliliter T-cel organoïde kweekmedium en plaats de VEE-suspensie op ijs totdat de T-cellen klaar zijn voor co-kweek. Controleer bij het verzamelen van T-cellen de rustende T-cellen onder een lichtmicroscoop om de grootte en algehele gezondheid te beoordelen. Bevestig dat de T-cel enige clustering, vergrote morfologie vertoont en geen zichtbare celresten of fragmenten vertoont.

Met een P1000-pipet wordt de T-cellen opnieuw opgehangen door meerdere keren op en neer te pipetteren in elke hoek van de put. Verzamel een kegelvormige buis en tel het totale aantal levende CD8 T-cellen. Plaats vervolgens de T-cel suspensie in de centrifuge en draai vijf minuten op 584 G bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant en suspendeer de T-celpellet opnieuw in 10 milliliter T-cel organoïde kweekmedium. Vervolgens wordt het juiste aantal T-cellen overgebracht in de kegelvormige buis met de eerder voorbereide VEVO's om de cellen te combineren. Plaats de gecombineerde VEO- en T-cel-suspensie in de centrifuge en draai opnieuw op 584 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Na het weggooien van het supernatant worden de VEU's en T-cellen opnieuw opgehangen in het juiste volume van basale membraanextract. Vervolgens wordt de suspensie met een andere pipettip op de voorverwarmde weefselkweekplaat geplaatst, waarbij je 20 microliter per put doseert voor een 24-put plaat. Draai nu de weefselkweekplaat om en plaats deze ondersteboven in een broedmachine van 37 graden Celsius.

Houd 30 minuten voor volledige adhesie en stolling van het basale membraanextract. Na de incubatieperiode voeg je zorgvuldig het aangevuld complete T-cel organoïde kweekmedium toe aan elke put. Doseer 500 microliter per put voor een 24-put plaat of 250 microliter per put voor een 96-put plaat, waarbij het medium tegen de zijkant van de put wordt toegevoegd om te voorkomen dat het basale membraanextractdruppeltje wordt verstoord.

Vervang het kweekmedium elke twee dagen totdat de monsters zijn verzameld voor flowcytometrie-analyse. Zeven dagen oude muis-VEO's geïnfecteerd met het lymfatisch choriomeningitisvirus dat gele fluorescerende eiwitten tot expressie bracht, vertoonden al na vier uur na co-kweek overvloedige virale replicatie, zichtbaar als de fluorescerende signalen binnen de organoïden. De ophoping van CD8 T-cellen nabij geïnfecteerde organoïden werd later tijdens de co-kweek prominent.

Progressieve aggregatie van CD8 T-cellen was geassocieerd met een zichtbare vermindering van het gele fluorescerende eiwitsignaal in geïnfecteerde organoïden op latere tijdstippen. CD8 T-cellen die samen met geïnfecteerde VEVO's werden gekweekt, vertoonden in de loop van de tijd een verhoogde expressie van CD 69 en CD 103, wat wijst op de verwerving van een weefselresident geheugenfenotype. Antigen-gestimuleerde CD69-positieve, CD103-positieve CD8 T-cellen vertoonden een significante toename in de productie van intracellulaire interferongamma en interleukine 2 vergeleken met niet-gestimuleerde controles.

Dit protocol maakt in vitro studie van CD8-resident geheugen T-cellen mogelijk, waardoor een efficiënte manipulatie van epitheel- en T-cellen mogelijk is zonder afhankelijk te zijn van diermodellen. De belangrijkste uitdaging in dit protocol is het behouden van gezonde, levensvatbare T-cellen en vaginale epitheelorganoïden, aangezien slechte levensvatbaarheid of infectie de co-cultuuroverleving en experimentele uitkomsten aantasten. We richtten ons op flowcytometrische analyse, maar co-culturen kunnen worden verzameld voor kleuring, beeldvorming en sequencing.

Het veilige medium maakt downstream ELISA mogelijk.