Geoptimaliseerde analyse van eiwitten uit xenopus-eicellen en embryo's door immunoblotting

In de loop van het leven van een dier vinden er voortdurend sulfaatbeslissingen plaats, die een normale ontwikkeling en de gezondheid van een volwassen organisme mogelijk maken. Deze beslissingen zijn afhankelijk van specifieke eiwitten die naar sulfaatregulatoren worden verwezen. Het doel van ons onderzoek is om de mechanismen te vinden die de synthese van deze kritische regulatoren controleren.

Naast het geven van een gedetailleerd overzicht van immunoblotting en Xenopus eicellen en embryo's, geeft ons protocol inzicht in de uitdagingen die dit modelorganisme gemeen hebben, zoals het verkrijgen van antilichamen. Door diepgaande studie van de bindings- en onderdrukkingsmechanismen van Bicaudal C, heeft ons onderzoek bijgedragen aan het leggen van een basis van informatie waarmee andere translationele regulatoren kunnen worden vergeleken. Om te beginnen met het verwerken van cellen voor immunoblotting, voegt u 10 microliter lysisbuffer met gekoelde cellen toe, verdund tot een eenmalige concentratie met dubbel gedeïoniseerd water per embryo of eicel.

Homogeniseer de monsters met behulp van een microstamper op ijs. Plaats de buisjes in een tafelcentrifuge en draai de monsters gedurende 10 minuten op 5.000 g bij vier graden Celsius om resten, inclusief dooier en onoplosbare pigmenten, te pellets. Breng het bovenstaande over in een schone buis van 1,5 milliliter en zorg ervoor dat de pellet tijdens het overbrengen niet wordt verstoord.

Voeg een gelijk volume van tweemaal Laemmli monsterbuffer aangevuld met 5% gewicht per volume 2-mercaptoethanol toe aan het verzamelde supernatant. Verwarm het mengsel gedurende 10 minuten op 95 tot 100 graden Celsius om de eiwitten te denatureren. Haal nu een 4 tot 12%bis-tris SDS precast gel uit de verpakking en verwijder de sticker van de onderkant van de gel.

Plaats de gel in de elektrode-eenheid tegenover een bufferdam en plaats het hele apparaat in een verticale elektroforesetank. Vul vervolgens zowel de elektrodeconstructie als de bodem van de tank met Tris-MOPS-SDS loopbuffer. Verwijder voorzichtig de gelkam en de pipetbuffer in de putjes om luchtbellen te verwijderen en de buffer in evenwicht te brengen.

Laad nu vijf microliter voorgekleurde eiwitstandaarden in de eerste put en 10 microliter van elk voorbereid monster in de resterende putjes. Plaats het deksel op de elektroforesetank en sluit deze aan op een stroomvoorziening. Stel vervolgens de spanning in op 200 volt om de elektroforese te starten.

Stop de elektroforese zodra het kleurstoffront van de monsterbuffer de gel verlaat. Voordat de elektroforese is voltooid, begint u met het monteren van de transfersandwich in de transferclip. Vul een glazen ovenschaal met gekoelde transferbuffer en dompel tijdens de montage alle transfermaterialen onder in deze buffer.

Plaats de transferclip in de schaal met de zwarte helft tegen de bodem, de witte helft naar boven gericht en de clip naar links geopend. Leg een of twee vezelsponzen plat op de zwarte helft van de transferclip. Nadat u twee stukken cellulosechromatografiepapier van 0,35 millimeter op maat hebt gesneden, legt u er een op de sponzen.

Zodra de elektroforese is voltooid, verwijdert u de gel uit de elektroforesetank. Wrik met behulp van de openingshendel van de gelcassette de gelplaten voorzichtig uit elkaar, terwijl u ervoor zorgt dat de gel aan één kant blijft zitten. Snijd de putjes van de bovenkant van de gel af met behulp van de gel releaser.

Plaats de gel, die nog aan de ene helft van de plastic cassette vastzit, op het filterpapier en verwijder de resterende cassettehelft zodat de gel plat op het papier blijft liggen. Snijd vervolgens een stuk nitrocellulosemembraan van 0,45 micrometer af dat overeenkomt met de afmetingen van de gel. Haal het membraan uit het beschermpapier, maak het kort nat in de overdrachtsbuffer en plaats het voorzichtig op de gel.

Leg vervolgens een tweede stuk filtreerpapier op het nitrocellulosemembraan. Druk met een roller voorzichtig maar stevig alle luchtbellen eruit. Stapel een of twee extra vezelsponzen op het filterpapier om de sandwich compleet te maken.

Sluit de transfercassette en klem deze stevig vast om de gemonteerde sandwich af te sluiten. Steek vervolgens de gesloten transfersandwich in de transferkern met de clip naar boven en zorg ervoor dat de zwarte kant van de clip naar de zwarte kant van de kern wijst. Plaats de overdrachtskern in de elektroforesetank.

Voeg een ijspak en een roerstaaf toe aan de tank en zorg ervoor dat de roerstaaf vrij kan draaien. Vul de tank met gekoelde overdrachtsbuffer totdat het apparaat volledig is ondergedompeld en bevestig het deksel aan de bovenkant. Sluit het apparaat aan op de voeding, pas de elektrodekleuren aan en stel de omstandigheden in op 100 volt gedurende een uur terwijl de roerstaaf draait.

Zodra de overdracht is voltooid, opent u voorzichtig de cassette en haalt u de sandwich uit elkaar. Verwijder het nitrocellulosemembraan en markeer de kant die in contact was met de gel. Plaats vervolgens het nitrocellulosemembraan in een klein bakje zodat het plat tegen de bodem ligt.

Bedek het membraan volledig met Ponceau-beits en schud voorzichtig op een wip gedurende 5 tot 10 minuten. Spoel na het gieten van de Ponceau-vlek het membraan meerdere keren af met dubbel gedeïoniseerd water totdat de overtollige vlek is verwijderd en eiwitbanden zichtbaar worden in de rijstroken. Voer vervolgens membraanblokkering, antilichaamincubatie en wasstappen uit zoals weergegeven.

Zodra de incubatie en het wassen van secundaire antilichamen zijn voltooid, is het membraan klaar voor beeldvorming. Zet in een donkere kamer de filmontwikkelaar aan en laat hem opwarmen. Knip twee vierkanten plasticfolie af die groot genoeg zijn om het membraan volledig te bedekken.

Plaats met een tang het nitrocellulosemembraan met de bedrukte zijde naar boven op het eerste vierkant plasticfolie. Meng in een buis van 1,5 milliliter gelijke hoeveelheden van de verbeterde chemiluminescentieluminol en versterkerreagentia. Gebruik vervolgens ongeveer een milliliter van het mengsel om de meeste membranen te bedekken.

Manipuleer het membraan voorzichtig met behulp van de plasticfolie om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak gelijkmatig is bedekt en incubeer gedurende een minuut. Verwijder vervolgens overtollig ECL-reagens door het membraan met een tang vast te pakken en de vloeistof lichtjes af te schudden. Plaats het membraan met de bedrukte zijde naar boven op het tweede vierkant plasticfolie, vouw het losjes over het membraan en plak de folie stevig vast in een autoradiografiecassette.

Maak vervolgens een beeld van het membraan met behulp van een autoradiografiefilm in een donkere kamer door de getoonde stappen te volgen. Nadat de gewenste eiwitvisualisatie is bereikt, lijnt u de ontwikkelde film uit met de glow-in-the-dark-markeringen en gebruikt u deze als richtlijn om de positie van de voorgekleurde eiwitstandaarden op de film te markeren. Zodra de beeldvorming is voltooid, verwijdert u voorzichtig het membraan van de plasticfolie en dompelt u het onder in TBSTW om het resterende ECL-reagens af te wassen.

Ponceau-kleuring van het membraan bevestigde een succesvolle eiwitoverdracht. Endogeen B1-eiwit werd niet gedetecteerd in eicelmonsters, maar werd duidelijk gedetecteerd in embryomonsters van stadium zeven en stadium 10,5 bij ongeveer 107 kilodalton. Een kleinere eiwitband van 70 kilodalton werd gedetecteerd in geïnjecteerde monsters in alle stadia met behulp van het Bicc1-antilichaam, wat wijst op succesvolle expressie van de HA-Bicc1 C-terminale fusie.

Het HA-antilichaam detecteerde dezelfde 70-kilodaltonband alleen in geïnjecteerde monsters, wat de specificiteit van het Bicc1-antilichaam voor het fusie-eiwit bevestigt. Twee banden met een hoog moleculair gewicht, ongeveer 250 en 270 kilodalton, werden gedetecteerd in alle monsters met behulp van het CNOT1-antilichaam. Expressie van het 54-kilodalton DDX6-eiwit werd gedetecteerd in alle monsters, maar was zichtbaar verminderd in stadium 10.5-embryo's.