Voorbereiding en verwerking van verkalkte slagader met geconserveerde morfologie en RNA voor digitale ruimtelijke profilering

Ruimtelijke transcriptomics biedt een voordeel ten opzichte van zowel single-cell RNA seq als bulk RNA seq door ruimtelijke informatie binnen het weefsel te behouden. Door gebruik te maken van tools zoals RNAscope, computationele deconvolutie en publiek beschikbare single-cell datasets, is het mogelijk om cellulair gedrag in kaart te brengen naar hun niche- en genprofielen en een geïntegreerd beeld van weefselbiologie op te bouwen. Deze technologie explodeert.

Twee artikelen van mei 2025 in Nature richten zich op studies naar ruimtelijke transcriptomiek. Als we PubMed in kaart brengen, is de curve nog steiler: ongeveer 150 ruimtelijke artikelen in 2023, bijna 300 in 2024, en op weg om in 2025 meer dan 500 publicaties te overschrijden. Ruimtelijke transcriptomiek heeft al verschillende belangrijke onderzoeksgebieden veranderd, zoals kankerbiologie, neurowetenschap, immunologie en ontwikkelingsbiologie.

Toch loopt de vaatbiologie achter. De heterogeniteit en unieke geometrie van slagaders en aders maken ze uitdagend voor weefselhechting en RNA-behoud. Daarnaast bevatten geavanceerde vasculaire laesies verkalking en trombose, wat de weefselintegriteit verder vermindert.

Dit protocol is specifiek ontworpen voor vatachtige structuren. We nemen ook methodologieën op om de kosten en de noodzakelijke kleuringsprocessen te verlagen voor het beoordelen van RNA, calciumafzetting en cellen van belang. Gezien de huidige schaarste aan vasculair gerichte ruimtelijke transcriptomica-studies vergeleken met andere vakgebieden, is dit protocol ontworpen om kostenefficiënt en toegankelijk voor beginners te zijn, en biedt vasculaire onderzoekers toegankelijke hulpmiddelen om ruimtelijke transcriptomics in hun studies toe te passen.

Dit protocol is ook potentieel nuttig voor grote cohortmonsters voor klinische experimenten. In dit protocol beschrijven we gedetailleerde procedures over de zorgvuldige behandeling van verkalkte arterieweefsels, eigenschappencalcificatiemethoden gericht op het behouden van RNA-kwaliteit en weefselmorfologie, kleuringstechnieken voor verificatie en begeleiding tijdens ROI-selectie, en de definitieve morfologische markerkleuring op voorbereide preparaten, zodat ze klaar zijn voor verwerking op het digitale ruimtelijke profilerinstrument. Menselijke tibiaarteries, waaronder de anterieure tibia, posterieure tibiale en perineale arterie, werden geoogst uit amputatiemonsters van de patiënt en opgeslagen in DMEM met 1% HEPES en 1% Pen-Strep.

Elke slagader wordt samen met het medium overgebracht naar een 100-millimeter petrischaal. Overtollig perivasculair bindweefsel wordt verwijderd met steriele schaar en pincet, waarbij alleen de arteriële wand overblijft. De getrimde slagader wordt overgebracht naar een nieuwe petrischaal.

Een steriele snijplank wordt in het gerecht klaargemaakt. De slagaders worden met een chirurgisch mes in segmenten van één centimeter gesneden. Twee segmenten van elke slagader worden in cryobuizen in vloeibare stikstof ingevriesd voor cryopreservatie en opslag voor toekomstig eiwit- of RNA-werk.

De overige segmenten worden geplaatst in 15-milliliter buizen met 10% neutrale gepufferde formaline en worden vastgezet op vier graden Celsius gedurende 24 tot 48 uur. De decalcificatieoplossing met 10% EDTA in een RNA-stabiliserende oplossing wordt voorbereid, waarbij de pH wordt aangepast naar 5,2 voor de werkoplossing. De vaste weefsels worden overgebracht naar een nieuw schaaltje met PBS, en de weefsels worden kort gewassen.

Elk monster wordt overgebracht in een buisje van 15 milliliter met decalcificatieoplossing en 72 uur lang op vier graden Celsius geroerd. Na de ontkalking worden de monsters twee keer gewassen met PBS en zachte beweging gedurende vijf minuten. Weefsels worden overgebracht naar cassettes.

De cassettes worden in een weefselprocessor geplaatst. De formalineverwerking duurt minstens vier uur. De tijd kan worden gevarieerd afhankelijk van de monstermatrix.

Meerdere arteriesegmenten worden per blok geplaatst. Het blok wordt gevuld met paraffine en laat volledig afkoelen. Glaasjes worden voorbereid door het beperkte weefselgebied op de achterkanten van de glaasjes te markeren.

Bevestig dat alle segmenten binnen het beperkte gebied vallen dat vereist is door het GeoMx DSP-instrument. Overtollige paraffine wordt van de blokken verwijderd. De blokken worden vervolgens in vijf micrometer gesneden met laagprofielbladen.

De weefsellinten worden bevestigd in het gemarkeerde gebied. Er zijn minstens vier seriële secties per blok gemonteerd voor verschillende kleuringen in het DSP-experiment. Bewaar de glaasjes op vier graden Celsius tot gebruik.

Vervolgens wordt RNAscope in-situ hybridisatie en histologische kleuring uitgevoerd op seriële preparaten. Daarnaast is een andere set preparaten gekleurd met morfologische markers, zoals CD45 voor immuuncellen en alfa-SMA voor gladde spiercellen. De RNAscope in-situ hybridisatieprocedure bestaat kort uit vier hoofdstappen: dia-baking als voorbehandeling, standaard deparaffinisatie en rehydratatie, doelopvang, probe-hybridisatie met signaalversterking en kleurstof kleuring voor RNA-visualisatie.

Voor histologische validatie worden zowel H&E-kleuring als Alizarin Red S-kleuring uitgevoerd om nauwkeurige lokalisatie van calciumafzettingen mogelijk te maken. Ten slotte wordt morfologische markerkleuring uitgevoerd met een standaard immunohistochemieprotocol om de cellen van belang te identificeren, wat de ROI-selectie begeleidt. In deze studie werden twee op EDTA gebaseerde protocollen vergeleken: één, 10% EDTA alleen gedurende 72 uur, en twee, 10% EDTA- en RNA-stabiliserende oplossing voor dezelfde duur.

Morfologie en RNA-kwaliteit werden beoordeeld met RNAscope in-situ hybridisatie. Beide methoden behielden de vatarchitectuur, maar glaasjes behandeld met de EDTA- en RNA-stabiliserende oplossingscocktail vertoonden duidelijk sterkere RNA-signalen, zoals aangetoond in het rechterpaneel, wat aangeeft dat RNA-stabiliserende oplossing transcripten beschermt terwijl EDTA kristallijn calciumfosfaat keleert en het monster geleidelijk verzacht zonder RNases te activeren. Met de RNA-behoudsstrategie geoptimaliseerd en de kwaliteit bevestigd, demonstreren we de stappen voor histologische kleuring voor calciumafzetting met behulp van hematoxyline en eosine en Alizarin Red S. Alizarin bindt selectief ionische calciumzouten en verandert in tint van oranje naar baksteenrood, waardoor micro- en macrocalcificaties gevoelig worden benadrukt, hoewel het minder cellulaire en extracellulaire matrixdetails geeft dan H&E.

Het gebruik van beide beitsen maximaliseert de structurele en compositie-informatie. Na morfologische markerkleuring worden de dia's gescand op het GeoMx-platform. Antilichaam CD45 markeert immuuncellen, terwijl alfa-gladde spieractine vaatvormige gladde spiercellen markeert die overvloedig aanwezig zijn in het medium.

De geselecteerde ROI's omvatten ongeveer 100 tot 150 kernen met voldoende RNA-opbrengst. De ROI's werden naast en ver van verkalkte gebieden geplaatst om ruimtelijke genexpressiepatronen te vergelijken die relevant zijn voor mediale verkalking van de tibia-arterie. Ondanks enig weefselverlies tijdens de meerurige verwerkingsstappen, werden in elke arteriesectie meerdere geschikte ROI's vastgesteld.

Tot slot omvat deze workflow het behandelen van verkalkt arterieweefsel en decalcificatie via validatiekleuring en ROI-selectie voor een ruimtelijke transcriptomica-studie. In het bijzonder zorgt het combineren van H&E met calcium-specifieke Alizarin-kleuring voor een precieze lokalisatie van vasculaire verkalking en maximaliseert zowel structurele als samenstellende informatie voor ROI-plaatsing. RNAscope-analyse toont aan dat gedecalcificeerde arteriële secties grotendeels intact blijven met voldoende RNA.