Name: Shrinky-Dink Opknoping Drops: een eenvoudige manier om vorm en cultuur Embryoid Bodies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor embryoid body-vorming met gecontroleerde celnummers in micro-gefabriceerde putjes. Deze techniek vermindert handmatig werk en verbetert de reproduceerbaarheid in stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag CIRM bedanken voor de ondersteuning van dit werk. De cellijn werd gedoneerd van Dr Andras Nagy het Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario.

1. Het maken van Shrinky-Dink Mold <ol><li> Druk het gewenste patroon op Shrinky-dink vel met behulp van een goede definitie printer. </li><li> Bak Shrinky-dink vel bij 163 ° C gedurende ongeveer 10 minuten, of totdat ze volledig zijn gekrompen en de verwerving van een regelmatige vorm. </li><li> Na Shrinky-dink mal is afgekoeld, ondergedompeld in een bad met isopropanol totdat het gehele oppervlak is nauwelijks bedekt. </li><li> Zorgvuldig, spuit wat aceton op de mal en schud de verpakking een paar keer. Voeg meer isopropanol uit te spoelen aceton eigen risico en deze stap enkele keren herhalen totdat Shrinky-mould ziet er schoon. </li><li> Dompel schimmel in gedestilleerd water gedurende 10 minuten te wassen alle resterende organische oplosmiddelen. </li><li> Lucht schoon Shrinky-mal. Het opnieuw vuur ongeveer 5 minuten op 163 ° C. Dit zal compacte inkt en verdampen van de resterende oplosmiddel. </li></ol> 2. Het maken van PDMS microwells <ol><li> Maak een 10:01 PDMS / verharder mengsel, en schud krachtig gedurende enkele minuten. </li><li> Plaats Shrinky-Dink schimmel in een petrischaaltje. Giet PDMS mengsel tot hij ongeveer 1 / 2 cm boven de mal oppervlak. </li><li> Plaats schaaltje onder vacuüm bel om alle bubbels te elimineren uit PDMS mengsel. </li><li> Plaats schotel in de oven op 70 ° C, &#39;s nachts. </li><li> Afgesneden solide PDMS van schimmel en bind het aan een glasplaatje alleen door druk uit te oefenen. </li><li> Gooi eerste microwell-chip, want het heeft inktresten ingelegd tussen PDMS. </li><li> Herhaal deze procedure om een ​​tweede chip die is inkt-vrij en heeft een meer gedefinieerde vorm te produceren. </li><li> Schone microwell-chip met behulp van 70% ethanol oplossing. Plaats het onder UV-licht bron gedurende 10 minuten om het te steriliseren. </li></ol> 3. Trapping cellen in microwells <ol><li> Tellen cellen en verdun ze in cultuur media tot de gewenste concentratie (afhankelijk van het aantal cellen in de eerste bronnen u wilt). Bijvoorbeeld, om circa 10-15 cellen per well (gemiddelde = 11, SD = 5,4, densiteit = 93%) te krijgen, gebruikten we een concentratie van 8 × 10 4 cellen / ml. Voor een concentratie van 17 × 10 4 cellen / ml, kunnen we betrouwbaar te krijgen tussen de 25 en 35 cellen per well (gemiddelde = 27,17857 SD = 7,7, densiteit = 100%). </li><li> Plaats voorzichtig microwell chip in een centrifugebuis van 50 ml bevat een gestolde PDMS basis. </li><li> Voeg ongeveer 2JDP ml van de cel oplossing. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 760 rpm en 4 ° C. </li><li> Pipet uit overtollige oplossing en zorgvuldig microwell wassen met PBS 1X oplossing. </li><li> Plaats microwell in een kleine Petry schotel, en let tijdens het gebruik van de chip uit de centrifugebuis. </li><li> Was de cel overschot met behulp van een X PBS-oplossing. </li><li> Plaats microwell chip onder een omgekeerde microscoop om beoogde aantal cellen per putje te controleren. </li><li> Incubeer microwell met cellen in normale omstandigheden. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Afbeelding-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Cel incubatie <ol><li> Volg de normale EB-protocol in het lab. </li><li> Verander het medium langzaam van de kant van de kamer, niet te storen de cel in de microwell. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

We hebben een eenvoudige, snelle en schaalbare methode om cultuur vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten (gevormd uit Shrinky-Dinks) en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling. Tot slot, deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk voor verdere analyse en experimenten. Deze methode is vatbaar voor een lab en vereist geen speciale apparatuur, omdat wij overbodig fotolithografie. We kunnen variëren van de grootte van de microwells evenals de concentratie van cellen / putten om het aantal en de grootte ...

Voor de Mesc media (McCloskey lab protocol): (voor geprepareerde media totaal: 50 ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1 ml 2 mM L-glutamine: 0,5 ml, 1 ml NEAA: 0,5 ml; 1 ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Verwaterde BME:. 50ul; 100ul (Voeg 35ul van steriel gefiltreerd BMT aan 5 ml PBS en spuitfilter steriliseren Gooi na 2 weken. uiteindelijke concentratie in de oplossing is 0,1 mM)

shrinky-dink opknoping drops: een eenvoudige manier om vorm en cultuur embryoid bodies

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid organen (EB) zijn aggregaten van embryonale stamcellen. De meest voorkomende manier van het creëren van deze aggregaten is de opknoping neerzetten, een moeizame aanpak van het pipetteren een willekeurig aantal cellen in well platen. De interacties tussen de stamcellen gedwongen in de nabijheid van elkaar bevordert de generatie van de EBS. Omdat de media in elk van de putten moet handmatig worden uitgewisseld elke dag, deze aanpak wordt met de hand intensief. Bovendien, omdat de milieu-parameters zoals cel-cel, cel-oplosbare factor interacties, pH en beschikbaarheid van zuurstof kan worden functies van EB grootte, kan celpopulaties verkregen uit de traditionele opknoping daalt ook sterk variëren indien gekweekt onder identieke omstandigheden. Recente studies hebben inderdaad aangetoond dat het aanvankelijke aantal cellen die het aggregaat kan aanzienlijke gevolgen stamcellen differentiatie. We hebben een eenvoudige, snelle en schaalbare methode om cultuur vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling. Tot slot, deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk voor verdere analyse en experimenten. Deze methode is vatbaar voor een lab en vereist geen speciale apparatuur. Laten we zien deze methode door het creëren van embryoid lichamen met behulp van een rode fluorescerende muizen cellijn (129S6B6-F1).

We tonen een eenvoudige en snelle methode om vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling.

Shrinky-Dink Opknoping Drops: een eenvoudige manier om vorm en cultuur Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) zijn aggregaten van embryonale stamcellen. De meest gebruikte methode om deze aggregaten te creëren is de hanging-drop-methode, een arbeidsintensieve ...

Embroid bodies zijn aggregaten van embryonale stamcellen. De meest gebruikelijke methode om deze aggregaten te creëren is de hanging-dropmethode. Een arbeidsintensieve aanpak waarbij een willekeurig aantal cellen in wellplaten wordt gepipetteerd.Het proces is arbeidsintensief omdat het medium en elke wellplaat dagelijks handmatig moeten worden vervangen. Bovendien hebben recente studies aangetoond dat het initiële aantal cellen dat het aggregaat vormt, invloed kan hebben op de differentiatie van stamcellen. Met deze methode is er geen mogelijkheid om het aantal cellen vooraf te bepalen.In deze video laten we een eenvoudige en snelle methode zien om verschillende aantallen cellen in micro-gefabriceerde putjes te laden voor de ontwikkeling van embryoïde lichamen. Hallo, ik ben Jonathan Pagan uit het lab van Michelle K aan de School of Engineering van de University of California Merced, en ik ben Jesus Luna, ook uit het lab van K. Vandaag laten we u een procedure zien voor het creëren van embryoïde lichamen in micro-gefabriceerde putjes middels centrifugatie.Deze procedure omvat de volgende stappen: het vervaardigen van een microapparaat, het laden van de stamcellen en het voeden van de stamcellen. Laten we beginnen. De eerste stap in deze procedure is het maken van de shrinky-dink mal met behulp van een printer met een hoge resolutie.Print het gewenste patroon op shrinky-dink-vellen. Bak vervolgens het shrinky-dink-vel gedurende ongeveer 10 minuten bij 160 °C, of totdat het volledig is gekrompen en een regelmatige vorm heeft aangenomen. Laat de gekrompen inktvorm twee minuten afkoelen totdat deze koud aanvoelt.Dompel het onder in een isopropanolbad tot het volledige oppervlak net bedekt is. Nadat de krimpende inktmal in de isopropanol is ondergedompeld, wordt er voorzichtig wat aceton over de mal gespoten en wordt de container een paar keer geschud. Voeg vervolgens meer isopropanol toe om het overtollige aceton uit te spoelen en herhaal deze stap een paar keer totdat de krimpende inktmal er schoon uitziet.Dompel vervolgens de mal en gedestilleerd water gedurende 10 minuten onder om alle resterende organische oplosmiddelen af te wassen. Na het onderdompelen in water wordt de inkrimpend inktmal gereinigd met perslucht en vervolgens ongeveer vijf minuten opnieuw verhit bij 160 °C. Dit zorgt ervoor dat de inkt compact wordt en dat eventuele resterende oplosmiddelen verdampen.We kunnen nu overgaan tot het maken van de PDMS-microwells. We genereren de PDMS-microwells, die gebruikt zullen worden om de stamcellen te kweken voor de ontwikkeling van embryoïde lichaampjes. Bereid een mengsel van PDMS en uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 voor en schud dit gedurende enkele minuten krachtig.Giet vervolgens het PDMS-mengsel over de shrinky dink-mal in een kleine Petrischaal totdat het ongeveer een halve centimeter boven het maloppervlak reikt. Na het gieten kunnen er vaak bellen op de mal worden waargenomen die verwijderd moeten worden. Plaats de schaal gedurende 20 minuten onder een vacuümklok om alle bellen uit het PDMS-mengsel te elimineren.Nadat is vastgesteld dat alle luchtbellen zijn verwijderd, wordt de schaal gedurende 20 minuten bij 7 °C in de oven geplaatst. Na de incubatie wordt het gestolde PDMS met een scheermesje uit de mal gesneden. Maak het schoon met plakband en bevestig het op een glazen objectglas met de putjes naar boven gericht.Dit gebeurt eenvoudig door druk uit te oefenen op de randen. Maak het vervolgens schoon met een 70% ethanoloplossing en plaats het gedurende 10 minuten onder een UV-lichtbron om het te steriliseren.De eerste keer dat u dit doet, zult u de PDMS weggooien. Dit helpt om eventuele resterende inkt van uw mal te verwijderen. Daarna kunt u de mal zoals hij is gebruiken.Herhaal de gietprocedure nogmaals om een tweede chip te produceren die inktvrij is en een meer gedefinieerde vorm heeft. Zorg ervoor dat er een ontlading wordt uitgevoerd gedurende 20 seconden voordat u begint, om een hydrofiel oppervlak te creëren voor eenvoudige belading. Nadat de PMS-microwells zijn gemaakt, kunnen deze worden gebruikt voor de studie van Enid-lichamen.Laten we nu verdergaan. Om te beginnen moeten de cellen worden geteld en verdund in celkweekmedium tot de gewenste concentratie, afhankelijk van het aantal initiële cellen per putje dat u wenst. Bij 1,5 × 10⁴ cellen per milliliter stelden we vast dat u 14 cellen per putje verkrijgt wanneer elk putje is gevuld.Voeg twee milliliters van de celoplossing toe aan een centrifugebuis van 50 milliliter die een gestolide PDMS-basis bevat. Plaats de microwell-chip voorzichtig in de centrifugebuis en centrifugeer vijf minuten bij 760 RPM. Pipetteer vervolgens het medium weg en plaats de microwell in een kleine Petrischaal.Zorg ervoor dat er niets wordt gemorst bij het uitnemen van de chip uit de centrifugebuis. Plaats de micro-well chip vervolgens onder een omgekeerde microscoop om te controleren of elke well is geladen. Plaats de chip in de houder en incubeer de micro-wells met cellen gedurende 24 uur onder standaardcondities.Om de cellen in stand te houden, kan het medium na 24 uur langzaam aan de zijkant van de kamer worden ververst. Vermijd het verstoren van de cellen in de micro-well; dit kan dagelijks worden uitgevoerd.Het voordeel is dat u één keer pipetteert en al het medium vervangt, in tegenstelling tot het vervangen van het medium voor elke individuele put, zoals bij conventionele hangende druppels. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u cellen kunt kweken en embryoïde lichaampjes kunt creëren met behulp van shrinky dink-mallen. Deze methode is uiterst nuttig omdat deze eenvoudig en snel is en minder arbeidsintensief dan de methode met hangende druppels. Deze methode vereist geen fotolithografie.Daarnaast kunnen we het aantal cellen waarmee we onze embryoïde lichaampjes starten controleren. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien hoe in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen te voeren om embryoid lichamen met behulp van de opknoping drop methode.

In vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (MES) cellen met behulp van de Opknoping neerzetten

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

This video demonstrates an assay to generate cerebral organoids from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Human iPSCs are induced to form embryoid bodies (EBs). The EBs are cultured over a polymer scaffold using an induction medium, promoting differentiation into neural stem cells, progenitor cells, and immature neurons. Finally, the EBs are embedded in a matrix and transferred to a maintenance medium for cerebral organoid formation.

Generating Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids

This video demonstrates the process of generating neuron balls using a hanging drop culture technique. Within the hanging drops, cells move towards the bottom, self-assembled into three-dimensional structures forming neuron balls, which can be used for neurobiological studies.

Developing Neuron Balls Using a Hanging Drop Culture Technique

The video demonstrates the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) to embryoid bodies (EBs) by the hanging drop method. Upon suspending the mESCs in hanging drops and incubating, the cells aggregate to form EBs, which are further differentiated into neuronal progenitor cells (NPCs) using a differentiation medium supplemented with retinoic acid (RA).

Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method

This video showcases the utilization of a lateral soft light illumination technique to improve the naked-eye visualization of embryoid bodies, thereby facilitating their manipulation and transfer during cerebral organoid culture. It elucidates the setup of soft light illumination, methods for media changes and embryoid body transfer, as well as the procedure for inducing neural differentiation in embryoid bodies for cerebral organoid development.

A Technique to Optimize Cerebral Organoid Culture Using Lateral Soft Light Illumination

De ex vivo rechtopstaande druppelcultuur is een alternatief voor huidige in vitro en in vivo experimentele technieken. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en vereist kleinere hoeveelheden reagens, terwijl het de mogelijkheid biedt om foetale vasculaire vorming, morfogenese en organogene te manipuleren en te bestuderen.

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Hier beschrijven we een protocol om nierorganoïden te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's). Dit protocol genereert nierorganoïden binnen twee weken. De resulterende nierorganoïden kunnen worden gekweekt in grootschalige spinnerkolven of magnetische roerplaten met meerdere bronnen voor parallelle medicijntestbenaderingen.

Een vereenvoudigde methode voor het genereren van nierorganoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

Cerebrale organoïden bieden ongekende mogelijkheden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling en menselijke ziektepathologie. Hoewel er veel succes is geboekt met cerebrale organoïde kweeksystemen, zijn er nog steeds operationele problemen bij het toepassen van deze technologie. Het huidige protocol beschrijft een cerebrale organoïde procedure die mediumverandering en organoïde overdracht vergemakkelijkt.

Cerebrale organoïde cultuur vergemakkelijken via laterale zachte lichtverlichting

Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor de reproduceerbare generatie, het onderhoud en de veroudering van cerebrale organoïden afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Deze methode maakt het kweken en rijpen van cerebrale organoïden gedurende langere perioden mogelijk, wat het modelleren van processen die betrokken zijn bij hersenveroudering en leeftijdsgebonden pathogenese vergemakkelijkt.

Robuuste weefselfabricage voor langetermijnkweek van iPSC-afgeleide hersenorganoïden voor verouderingsonderzoek

Hier introduceren we een uitgebreid protocol voor het genereren en stroomafwaarts analyseren van menselijke hersenorganoïden met behulp van single-cell en single-nucleus RNA-sequencing.

Generatie en stroomafwaartse analyse van single-cell en single-nuclei transcriptomen in hersenorganoïden

Leer een eenvoudige methode voor embryoid body-vorming met gecontroleerde celnummers in micro-gefabriceerde putjes. Deze techniek vermindert handmatig werk en verbetert de reproduceerbaarheid in stamcelonderzoek.

Shrinky-Dink Opknoping Drops: een eenvoudige manier om vorm en cultuur Embryoid Bodies

Meer video's verkennen