Een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis en lamina propria-isolatie voor profilering van immuuncellen

Ons onderzoek richt zich op de ziekte die medisch fragiele baby's treft, genaamd necrotiserende enterocolitis. We streven ernaar de mechanismen van de immuunrespons in NEC te onthullen en strategieën te ontwikkelen voor vroege diagnose en preventie van de ziekte. Het is zeer uitdagend om de responsen van intestinale immuuncellen in neonatale NEC te bestuderen. Ons protocol vult deze kloof op door te laten zien hoe lamina propria immuuncellen kunnen worden geïsoleerd voor analyse via flowcytometrie.

Om te beginnen verkrijg je een kweek van enterische bacteriën die is gekweekt van een baby met necrotiserende enterocolitis totalis, of NEC. Op experimentele dag 0 om 15:00 uur pipetteer je een aliquot van 20 microliter van de kweek in een 15-milliliter kweekbuis met 2 milliliter Luria-Bertani bouillon. Incubeer de bacteriële cultuur op 37 graden Celsius gedurende 16 uur in een orbitale shaker ingesteld op 1G, waarbij het buisdeksel in een ventilatiepositie blijft.

Tegelijkertijd incubeer je een tweede kweekbuis met slechts 2 milliliter Luria-Bertani-bouillon als controlemethode om te controleren op eventuele besmetting. De volgende dag om 7:00 uur pipette je 125 microliter van de nachtelijke bacteriële kweek in een T75 celkweekfles met een ventileerd deksel met 25 milliliter Luria-Bertani bouillon. Bereid in totaal vier T75-kolven voor en incubeer twee uur in een rechtopstaande positie bij 37 graden Celsius in een orbitale shaker ingesteld op 1G.

Om 9:00 uur op experimentele dagen 1, 2 en 3 combineer je 16 milliliter zuigelingenvoeding met 8 milliliter puppymelk in een steriele 50-milliliter centrifugebuis om het formulemengsel te bereiden. Verwijder het supernatant uit twee 50-milliliter centrifugebuizen met de gepelleteerde bacteriële cultuur. Suspendeer elk van de twee pellets grondig opnieuw in 2 milliliter van de bereide formulemix.

Vervolgens breng je beide opnieuw gesuspendeerde mengsels over in de resterende formulemix om in totaal 24 milliliter NEC-formule te creëren. Label zes 50-milliliter centrifugebuizen met de zes voedingstijden. Pipetteer 4 milliliter van de NEC-formule in elk van de zes gelabelde buizen.

Bereid vervolgens zes wegwerp-aliquots lipopolysaccharide-kolon voor met 5 milligram per milliliter en bewaar ze in laagbindende microbuisjes bij 20 graden Celsius. Ontdooi vlak voor het voeden één lipopolysaccharide aliquot en vortex gedurende 15 seconden. Voeg een berekend volume lipopolysaccharide toe aan een 4-milliliter NEC-formulebuis en meng goed door te pipetteren.

Vul een 1-milliliter spuit met de voorbereide NEC-formule en verbind deze aan een neonatale PICC-lijn. Om de NEC-formule aan elke pup te geven via orale gavage, houd je de pup voorzichtig vast aan de losse huid aan de basis van de nek en houd je hem rechtop. De inbrengafstand van de PICC-lijn is gelijk aan de afstand van de mondhoek tot de bovenkant van de melkvlek in de maag.

Het optimale inbrengpunt op de PICC-lijn moet worden gemarkeerd met een permanente stift. Met een tang leid je de PICC-lijn naar de orofarynx en naar beneden naar de maag. Als er weerstand is, verwijder dan de PICC-leiding, herpositioneer deze en probeer opnieuw in te brengen.

Doseer langzaam 80 microliter NEC-formule in de maag. Houd de pup tijdens het voeren in de gaten op tekenen van aspiratie. Na het voeden verwijder je de PICC-lijn en observeer je de pup op zware ademhaling of braken.

Als er opbraak optreedt, dep dan de mond en neus van de pup met een laboratoriumdoekje met weinig pluis. Herhaal het voederproces op alle voedingsmomenten. Op experimentele dag 4 verkrijg je het darmweefsel van de geëuthanaseerde neonatale muizen.

Knip met een schaar de darm in de lengte af om deze te openen, en snijd deze vervolgens dwars in segmenten van 1-1,5 centimeter. Breng de darmsegmenten over in een centrifugebuis van 15 milliliter met 10 milliliter predigestieoplossing die is afgekoeld op ijs. Incubeer vervolgens de buis op 37 graden Celsius met continue rotatie gedurende 20 minuten om te beginnen met de weefseldissociatie.

Draai de buis voorzichtig om losgemaakt weefsel los te maken, en giet de inhoud vervolgens door een 100-micrometer celzeef die bovenop een 50-milliliter centrifugebuis wordt geplaatst. Overbreng de resterende weefselfragmenten in een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter met 10 milliliter verteringsoplossing, voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Incubeer het monster met continue rotatie gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius.

Vervolgens brengt je de inhoud over in een geautomatiseerde tissue dissociatiebuis. Voer het programma uit met vier 15-seconden afwisselende rotatiecycli van 15 seconden. Wanneer de dissociatie voltooid is, laat je de celsuspensie in de dissociatiebuis voorzichtig vortexen en centrifugeer je deze vervolgens op 300G gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius.

Aspireer het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren. Sussen de cellen opnieuw in 1 milliliter ijskoude door fluorescentie geactiveerde celsorteerbuffer. Plaats een zeef van 100 micrometer over een centrifugebuis van 50 milliliter.

Voer de resuspendeerde cellen door de zeef en was ze met 2 milliliter koude fluorescentie-geactiveerde celsorteer-buffer. Tel de geïsoleerde cellen en beoordeel de levensvatbaarheid met trypan blue of een levensvatbaarheidskleurstof. Centrifugeer het gewenste volume voor flowcytometrie op 300G gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius.

Er werd een significante vermindering van de overleving waargenomen in de NEC-behandelgroep vergeleken met de met dam gevoede controlegroepen. Een grove darmonderzoek van NEC-muizen toonde kenmerkende kenmerken van NEC, waaronder zichtbare tekenen van uitzetting, luchtophoping en pneumatose-darmintestinalis vergeleken met gezonde controles. Hematoxyline- en eosinekleuring toonde vlekkerige villusvernietiging en verstoorde darmarchitectuur bij NEC-muizen in vergelijking met intacte villi bij controles.

De expressie van IL1B-, CXCL2- en LCN2-boodschapper-RNA was significant hoger in de NEC-groep dan bij controlegroepen. Het totaal aantal CD45+immuuncellen in de intestinale lamina propria verschilde niet significant tussen NEC- en controlegroepen. De macrofagenniveaus waren significant verhoogd in NEC-darmen vergeleken met controles.

NEC-muizen vertoonden een verhoogd aandeel myeloïde cellen, met name monocyten en macrofagen, vergeleken met andere immuunsubtypes. Single-cell multiomics-benaderingen onthullen immuuncelsignaturen in NEC en bieden nieuwe inzichten in mechanismen en potentiële biomarkers. Het modelleren van NEC is een uitdaging omdat de ziekte multifactorieel is.

Het repliceren van de menselijke darmomgeving, immuunresponsen en microbiële invloeden bij neonatale muizen vereist zorgvuldige optimalisatie. Ons model integreert menselijk afgeleid microbioom, hypoxie en voeding met flesvoeding, waardoor het fysiologisch relevant is en afgestemd op gedetailleerde profilering van immuuncellen bij neonatale muizen.