Beeldvorming van levende cellen van endocytisch transport met behulp van gefunctionaliseerde nanobodies in gekweekte cellen

We bestuderen het endocytisch en retrograde verkeer van transmembraaneiwitten evenals de mechanismen die het transport toekennen. Om het eiwitverkeer van het celoppervlak te onderzoeken, worden conventionele antilichamen doorgaans gebruikt, maar deze kunnen cross-linking en lysosomale targeting bevorderen. Om te beginnen verkrijg je een pellet van Escherichia coli-bacteriën die is getransformeerd met VHH-mCherry.

Voeg 30 milliliter ijskoude bindingsbuffer met 20 millimolaire imidazol in PBS toe aan de bacteriële celpellet. Met een pipet moet je de pellet grondig opnieuw ophangen door op en neer te pipetten. Breng het opnieuw gesuspendeerde mengsel over in een gelabelde 50 milliliter centrifugebuis.

Vul de resuspendeerde cellen aan met 200 microgram lysozym per milliliter, 20 microgram per milliliter DNase I, één millimolair magnesiumchloride en één millimolair fenylmethylsulfonylfluoride. Na 10 minuten incuberen van de buis op kamertemperatuur, plaats je hem op een rotator van een einde over de achterkant en blijf je een uur incuberen bij vier graden Celsius. Vervolgens plaats je een zes millimeter solide probe-tip van de sonicator direct in de celsuspensie.

Mechanisch verstoor je de bacteriële cellen met drie sonicatiepulsen van één minuut op 40% amplitude en een duty cycle van één seconde aan en één seconde uit. Met een koelinterval van één minuut tussen elke puls. Na centrifugatie bewaar je het vrijgemaakte lysaat op ijs terwijl je voorbereidt op immobilisatie-metaalaffiniteitschromatografie met voorverpakte, eenmalige tag-zuiveringskolommen die ontworpen zijn voor zwaartekrachtstroomwerking.

Bevestig kolommen van nikkel-nitrilotriazijnzuur op een metalen standaard of een geschikte kolomhouder. Daarna laat ik de opslagbuffer volledig uit de kolom leeglopen. Evenwicht de kolom door 10 milliliter bindingsbuffer toe te voegen met 20 millimolaire imidazol in PBS.

Laat de buffer door de zwaartekracht passeren. Breng geleidelijk ongeveer 30 milliliter van het vrijgemaakte bacteriële lysaat aan op de evenwichtige kolom. Laat het door de zwaartekracht passeren en laat de doorstroming erdoorheen gaan.

Daarna was je de kolom door twee opeenvolgende volumes van 10 milliliter bindingsbuffer toe te brengen met 20 millimolaire imidazol in PBS. Eliuteer de gebonden nanolichamen door twee milliliter elusiebuffer met 500 millimolaire imidazol in PBS aan te brengen in een microcentrifugebuis van twee milliliter. Evenwicht een ontzoutingskolom die in een 50 milliliter buisadapter is geplaatst door vijf keer te spoelen met vijf milliliter PBS.

Laat de buffer volledig in de gepakte hars binnengaan en gooi dan de doorstroming weg. Na de laatste spoeling centrifugeer je de kolom op 1000 x g gedurende twee minuten. Plaats nu de kolom met de adapter op een nieuwe 50 milliliter opvangbuis nadat je de doorstroming hebt weggegooid.

Laad twee milliliter van de geëlueerde gefunctionaliseerde nano op de vooraf geequilibreerde ontzoutingskolom. Centrifugeer vervolgens opnieuw op 1000 x g gedurende twee minuten om het eluaat te verzamelen voordat VHH-mCherry-expressie en zuiverheid worden gevalideerd. Start de software van het geautomatiseerde live cell imaging systeem.

Breng de ibidi-microscopiekamer over naar de microscooptrap. Stel twee beeldvormingskanalen op met excitatie- en emissiefilters voor EGFP en mCherry. Kies voor een korte belichtingstijd en lage lichtintensiteit om fotobleeken te voorkomen.

Houd de instellingen constant voor alle experimenten. De instellingen kunnen verschillen per verslaggevers. Voor elke voorwaarde sla coördinaten van 10 verschillende gezichtsvelden met drie tot vier cellen in focus op in een puntenlijst.

Vervolgens maakt je één snapshot van elke positie in de puntenlijst om als referentieafbeelding te dienen, voordat VHH-mCherry wordt toegevoegd. Om endocytose te initiëren, voeg je voorzichtig 350 microliter voorverwarmde VHH-mCherry-oplossing toe aan elke put, terwijl verstoring van de monolaag wordt geminimaliseerd. Ga daarna verder met het verwerven van de afbeelding.

Voer een time-lapse opname uit voor 100 frames op 32e intervallen terwijl je 37 graden Celsius en 5% kooldioxide handhaaft. Om de endocytische opname van VHH-mCherry te analyseren, laad je de time-lapse beeldsets in de beeldanalysesoftware. Pas segmentatie- en trackingtools toe om geïnternaliseerde fluorescentie in de tijd te kwantificeren in verschillende interessegebieden.

Alle gefunctionaliseerde nanono-varianten werden gezuiverd tot een hoge opbrengst en zuiverheid, waarbij alleen VHH-mCherry een lichte proteolytische degradatie vertoonde. De afbraakproducten van VHH-mCherry werden bevestigd als individuele VHH-mCherry-domeinen met behulp van epitoopspecifieke immunoblotdetectie. Bij afwezigheid van BirA werd VHH-mCherry teruggewonnen met ongeveer 20 milligram per voorbereiding.

En biotinylatie werd bevestigd door streptavidine agarose pulldown van nanobody BSA-mengsels. EGFP-gelabelde fusie-eiwitten die in HeLa-cellen tot expressie worden gebracht, vertoonden subcellulaire lokalisatiepatronen die consistent zijn met hun endogene tegenhangers, waaronder perinucleaire lokalisatie van EGFP-CDMPR en EGFP-CIMPR. Exclusieve perinucleaire lokalisatie van EGFP-TGN46 en perifere lokalisatie van TfR-EGFP.

VHH-mCherry maakte levende celvisualisatie van endocytisch transport van EGFP-CDMPR mogelijk, wat een toenemende colokalisatie over 60 minuten liet zien. De opname van VHH-mCherry in EGFP-CDMPR expressieve cellen bereikte een plateau na ongeveer 43 minuten, met een halfwaardetijd van negen minuten. In TfR-EGFP-expressieve cellen hoopte VHH-mCherry zich snel op tussen cellulaire cellen met een halfwaardetijd van vier minuten en verzadiging na 20 minuten.

We hebben een veelzijdige toolkit ontwikkeld op basis van nanolichamen om het transport van elk transmembraaneiwit vanaf het celoppervlak te analyseren. We gebruiken fluorescerende nanobodies om oppervlakcargo-eiwitten te labelen en vervolgens bestuderen we hun endocytische transport met levende celmicroscopie. Met onze nanobody-gebaseerde live cell imaging-benadering willen we paden ontdekken die het vrachtvervoer van het oppervlak naar het trans-Golgi-netwerk aandrijven.