Name: Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer twee cellyse-methoden voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellen met SMAD2/SMURF2 als model. Deze vergelijking helpt onderzoekers bij het selecteren van geschikte technieken voor eiwitregulatiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system in breast cancer.</a> Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).</li>
<li>Fulcher, L. J., Batley, C., Sobajima, T., Barr, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+as+a+danger+signal+promoting+G1+arrest+after+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time as a danger signal promoting G1 arrest after mitosis.</a> Trends Cell Biol. 36 (2), 142-153 (2025).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+linear+ubiquitination+in+regulating+cell+death+and+correlative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The mechanism of linear ubiquitination in regulating cell death and correlative diseases.</a> Cell Death Dis. 14 (10), 659(2023).</li>
<li>Serratore, V., Lucibello, M., Malanga, D., Viglietto, G., De Marco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+and+DUBs%3A+A+bidirectional+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">Akt and DUBs: A bidirectional relationship.</a> Cell Mol Biol Lett. 30 (1), 77(2025).</li>
<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends Biochem Sci. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDH2+triggers+ROS-induced+cell+death+and+autophagy+by+promoting+NRF2+ubiquitination+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">BDH2 triggers ROS-induced cell death and autophagy by promoting NRF2 ubiquitination in gastric cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 123(2020).</li>
<li>Cappadocia, L., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation%3A+Structures%2C+chemistry%2C+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation: Structures, chemistry, and mechanism.</a> Chem Rev. 118 (3), 889-918 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATRA+upregulates+OTUD6B+to+recruit+CD8%2B+T+cells+to+suppress+colorectal+liver+metastasis+by+stabilizing+DDX5%2FSTAT3%2FCXCL11+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">ATRA upregulates OTUD6B to recruit CD8+ T cells to suppress colorectal liver metastasis by stabilizing DDX5/STAT3/CXCL11 axis.</a> Cell Death Dis. 16 (1), 521(2025).</li>
<li>Niu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP33+deubiquitinates+PRKN%2FParkin+and+antagonizes+its+role+in+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">USP33 deubiquitinates PRKN/Parkin and antagonizes its role in mitophagy.</a> Autophagy. 16 (4), 724-734 (2020).</li>
<li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> J Cell Mol Med. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li>
<li>Guo, Y., Zhao, Y., Cong, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Met1-linked+ubiquitination+in+cell+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Met1-linked ubiquitination in cell signaling regulation.</a> Biophys Rep. 10 (4), 230-240 (2024).</li>
<li>Di, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+c-Myc-WDR43+signalling+axis+promotes+chemoresistance+and+tumour+growth+in+colorectal+cancer+by+inhibiting+p53+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist+Updat%22%5BJournal%5D)">The c-Myc-WDR43 signalling axis promotes chemoresistance and tumour growth in colorectal cancer by inhibiting p53 activity.</a> Drug Resist Updat. 66, 100909(2023).</li>
<li>Liebl, M. C., Hofmann, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+p53+signaling+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of p53 signaling in colorectal cancer.</a> Cancers (Basel). 13 (9), 2125(2021).</li>
<li>Oikawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTUD1+deubiquitinase+regulates+NF-%CE%BAB-+and+KEAP1-mediated+inflammatory+responses+and+reactive+oxygen+species-associated+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">OTUD1 deubiquitinase regulates NF-κB- and KEAP1-mediated inflammatory responses and reactive oxygen species-associated cell death pathways.</a> Cell Death Dis. 13 (8), 694(2022).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinase+OTUD1+stabilizes+NRF2+to+alleviate+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinase OTUD1 stabilizes NRF2 to alleviate hepatic ischemia/reperfusion injury.</a> Redox Biol. 75, 103287(2024).</li>
<li>Moreau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+ixazomib%2C+lenalidomide%2C+and+dexamethasone+for+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Oral ixazomib, lenalidomide, and dexamethasone for multiple myeloma.</a> N Engl J Med. 374 (17), 1621-1634 (2016).</li>
<li>Stewart, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carfilzomib%2C+lenalidomide%2C+and+dexamethasone+for+relapsed+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Carfilzomib, lenalidomide, and dexamethasone for relapsed multiple myeloma.</a> N Engl J Med. 372 (2), 142-152 (2015).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+gut+microbial+nitrogen+recycling+and+cellular+uptake+of+ammonium+to+improve+bortezomib+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma.</a> Cell Metab. 36 (1), 159-175.e8 (2024).</li>
<li>De Silva, A. R. I., Page, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+detection+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination detection techniques.</a> Exp Biol Med (Maywood). 248 (15), 1333-1346 (2023).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of protein ubiquitination.</a> J Vis Exp. (30), e1293(2009).</li>
<li>Worboys, J. D., Palazón-Riquelme, P., López-Castejón, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+measure+ubiquitination+of+NLRs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Method to measure ubiquitination of NLRs.</a> Methods Mol Biol. 2696, 105-114 (2023).</li>
<li>DeCaprio, J., Kohl, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+lysis+of+cells+for+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Denaturing lysis of cells for immunoprecipitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 098616(2020).</li>
<li>Bass, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+technical+considerations+for+western+blotting+applications+to+physiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Med+Sci+Sports%22%5BJournal%5D)">An overview of technical considerations for western blotting applications to physiological research.</a> Scand J Med Sci Sports. 27 (1), 4-25 (2017).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+Technique%2C+theory%2C+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: Technique, theory, and troubleshooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Crane, J. L., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+and+TGF-%CE%B2+signaling+in+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-β signaling in bone remodeling.</a> J Clin Invest. 124 (2), 466-472 (2014).</li>
<li>Gough, N. R., Xiang, X., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+liver%2C+pancreas%2C+and+gastrointestinal+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in liver, pancreas, and gastrointestinal diseases and cancer.</a> Gastroenterology. 161 (2), 434-452.e15 (2021).</li>
<li>Tzavlaki, K., Moustakas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling.</a> Biomolecules. 10 (3), 487(2020).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+western+blot%5BTitle%5D)+AND+%22J+vis+exp%22%5BJournal%5D)">The western blot.</a> J vis exp. , e5065(2025).</li>
<li>Wu, M., Chen, G., Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+and+BMP+signaling+in+osteoblast%2C+skeletal+development%2C+and+bone+formation%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-β and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease.</a> Bone Res. 4, 16009(2016).</li>
<li>Jeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-15b-SMURF2-HSP27+axis+promotes+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">The miR-15b-SMURF2-HSP27 axis promotes pulmonary fibrosis.</a> J Biomed Sci. 30 (1), 2(2023).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMURF2+predisposes+cancer+cell+toward+ferroptosis+in+GPX4-independent+manners+by+promoting+GSTP1+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">SMURF2 predisposes cancer cell toward ferroptosis in GPX4-independent manners by promoting GSTP1 degradation.</a> Mol Cell. 83 (23), 4352-4369.e8 (2023).</li>
<li>Pi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SMURF2+expression+enhances+RACK1+stability+and+promotes+ovarian+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of SMURF2 expression enhances RACK1 stability and promotes ovarian cancer progression.</a> Cell Death Differ. 30 (11), 2382-2392 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtube</td><td>Servicebio</td><td>EP-150-M</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-treated cultured dish</td><td>Servicebio</td><td>CCD-100</td><td></td></tr><tr><td>6-well disk</td><td>Servicebio</td><td>CCP-6H</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG antibodies</td><td>Proteintech</td><td>20543-1-AP</td><td>dilutie gebruikt 1:200 voor IP 1:10000 voor WB</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibodies</td><td>Proteintech</td><td>MA5-15738</td><td>dilutie gebruikt 1:10000</td></tr><tr><td>Anti-HA antibodies</td><td>Proteintech</td><td>51064-2-AP</td><td>dilutie gebruikt 1:10000</td></tr><tr><td>Anti-IgG antibodies</td><td>CST</td><td>#3900</td><td>dilutie gebruikt 1:200 voor IP</td></tr><tr><td>Anti-MYC antibodies</td><td>Proteintech</td><td>60003-2-Ig</td><td>dilutie gebruikt 1:10000</td></tr><tr><td>Anti-SMAD2 antibodies</td><td>CST</td><td>#5339</td><td>dilutie gebruikt 1:200 voor IP 1:2000 voor WB</td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Servicebio</td><td>GC307006-5g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (pH=8.0)</td><td>Servicebio</td><td>G1207-1L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ABW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>Verwarming/Koelende droge bad</td><td>Guocheng</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hoge-glucose DMEM</td><td>Servicebio</td><td>G4515-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HRP-geconjugeerd Geit anti-Muis IgG Lichte Ketens </td><td>Abclonal</td><td>AS062</td><td>dilutie gebruikt 1:5000</td></tr><tr><td>HRP-geconjugeerd Muis anti-Konijn IgG Lichte Ketens </td><td>Abclonal</td><td>AS061</td><td>dilutie gebruikt 1:10000</td></tr><tr><td>Lipo8000</td><td>Beyotime</td><td>C0533</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Aladdin</td><td>M421264</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Labgic</td><td>CF1524R</td><td></td></tr><tr><td>NaCl poeder</td><td>Servicebio</td><td>GC102004</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500ML</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-FLAG-SMAD2</td><td></td><td></td><td>Voor zoogdier expressie</td></tr><tr><td>pCMV-HA-Ub</td><td></td><td></td><td>Voor zoogdier expressie</td></tr><tr><td>pCMV-MYC</td><td></td><td></td><td>Voor zoogdier expressie</td></tr><tr><td>pCMV-MYC-SMURF2</td><td></td><td></td><td>Voor zoogdier expressie</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Servicebio</td><td>G4003-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail zonder EDTA</td><td>TargetMol</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G agarose kralen</td><td>Beyotime</td><td>P2017</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membraan</td><td>Vayzme</td><td>E801</td><td></td></tr><tr><td>SDS poeder</td><td>Solarbio</td><td>S8010-500g</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE systeem</td><td>Aervicebio</td><td>BVE4-BVT4</td><td></td></tr><tr><td>Sonics</td><td>Uibra cel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl poeder</td><td>Biotopped</td><td>HST-0372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Servicebio</td><td>GC204003-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Servicebio</td><td>G4021-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Vriendelijk gedoneerd door Vayzme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Aladdin</td><td>M301573</td><td></td></tr></tbody></table>

vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met smad2/smurf2 als model

Comparative Strategies for Ubiquitination Detection in Mammalian Cell Lysates Using SMAD2/SMURF2 as a Model

Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model

Ubiquitination, a post-translational modification, is a critical regulator of intracellular protein function. Ubiquitination modulates protein functions ...

comparative-strategies-for-ubiquitination-detection-mammalian-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte...

Detectie van eiwit ubiquitinering

This video demonstrates the in vitro method for SUMOylation of substrate proteins using a sequential enzyme cascade. Further, the SUMOylated status of the protein is identified using the electrophoresis and immunoblotting technique.

SUMOylation Assay: An In Vitro Technique to Detect the SUMOylation Status of Substrate Proteins by Immunoblotting

Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.

Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen speelt in cellulaire processen en nauw gecoördineerd wordt door deubiquitination. Defecten in beide reacties ten grondslag liggen aan menselijke pathologieën. Wij bieden protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reactie in vitro met behulp van gezuiverde componenten.

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Dit protocol is ontworpen om de activiteit van ubiquitin-proteasome System (UPS) in verschillende cellulaire compartimenten van de knaagdieren hersenen efficiënt te kwantificeren. Gebruikers zijn in staat om de werking van UPS in nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties in hetzelfde dier te onderzoeken, waardoor de hoeveelheid tijd en het aantal dieren dat nodig is om deze complexe analyses uit te voeren, wordt verminderd.

Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Deze methode beschrijft de beoordeling van wereldwijde veranderingen in de ubiquitin ketentopologie. De beoordeling wordt uitgevoerd door de toepassing van een op massaspectrometrie gebaseerde gerichte proteomics-benadering.

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

De huidige studie biedt gedetailleerde in vitro ubiquitylatie assay protocollen voor de analyse van E3 ubiquitine ligase katalytische activiteit. Recombinante eiwitten werden tot expressie gebracht met behulp van prokaryote systemen zoals Escherichia coli-cultuur.

In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie

We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen te zuiveren met behulp van het p53 tumor suppressor-eiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd uit cellen onder strenge niet-condenserende en denaturerende omstandigheden.

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Leer twee cellyse-methoden voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellen met SMAD2/SMURF2 als model. Deze vergelijking helpt onderzoekers bij het selecteren van geschikte technieken voor eiwitregulatiestudies.

Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model

Meer video's verkennen