Epigenetische manipulatie van K562-cellen: dual-vector episomale strategie voor stabiele gerichte DNA-methylering met behulp van dCas9-DNMT3A en -HDAC1 fusie-eiwitten

Ons onderzoek heeft als doel een stabiel, niet-geïntegreerd systeem te ontwikkelen voor gerichte DNA-methylering, waarbij duurzame epigenetische bewerking in K562-cellen wordt onderzocht. Recente vooruitgang op het gebied omvat dual-effector CRISPR-dCas9-systemen, die epigenetische enzymen combineren voor synergetische, stabiele en lokaal specifieke epigenetische modificatie. Om te beginnen houd je K562-cellen in T75-kweekkolven op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en bevochtigde omstandigheden.

Kwantificeer het episomale DNA dat voor transfectie wordt gebruikt met behulp van een spectrofotometer op 260 nanometer. Gebruik acht microgram totaal plasmide-DNA per transfectie door vier microgram van elk plasmide voor een co-transfectie te bereiden en de benodigde hoeveelheid te mengen met 90 microliter ultrazuiver water. Voeg nu 10 microliter 3 molaire natriumacetaatoplossing en 2,5 volumes 100% ethanol toe aan de verdunde DNA-oplossing.

Meng de DNA-oplossing grondig en breng het een nacht uit bij 20 graden Celsius om DNA-precipitatie mogelijk te maken. De volgende dag centrifugeer je de DNA-neerslagbuis op 11.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast moet je het supernatant voorzichtig uit de buis verwijderen.

Voeg 500 microliter 70% ethanol toe aan de buis om de pellet te wassen, en centrifugeer opnieuw op 11.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het ethanolsupernatant volledig uit de buis en laat de DNA-pellet aan de lucht drogen totdat er geen zichtbare ethanol meer over is. Daarna susselt u de gedroogde DNA-pellet grondig opnieuw in 50 microliter DMEM.

Bewaar 400 nanogram van het opnieuw gesuspendeerde DNA ongeveer 2,5 microliter in een nieuwe buis en bewaar de plasmide-DMEM-oplossing bij vier graden Celsius tot verder gebruik. Voer het resterende DNA-monster uit op een 1%agarosegel om DNA-zuivering en integriteit te verifiëren. Oogst K562-cellen uit een T75-kolf wanneer de culturen een confluentie van 50 tot 60% bereiken om optimale transfectie-efficiëntie te garanderen.

Tel de geoogste cellen met een hemocytometer en breng een volume van twee keer tien tot de kracht van vijf cellen over in een 35 millimeter kweekschotel met 900 microliter DMEM zonder FBS of antibiotica. Plaats de kweekschaal in een broedmachine van 37 graden Celsius met 5% kooldioxide om de cellen klaar te houden voor transfection. Gebruik een lipofectamine-gebaseerde transfectiekit om plasmiden toe te dienen volgens de instructies van de fabrikant en indien nodig de volumes aan te passen.

Voeg drie microliter P3000-reagens toe aan de eerder voorbereide plasmide-DMEM-oplossing. Meng voorzichtig en laat het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur incuberen. Voeg nu vijf microliter Lipofectamine 3000-reagens toe samen met voldoende DMEM om een uiteindelijk volume van 100 microliter te bereiken.

Incubeer deze transfectiemix 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg de volledige 100 microliter van het transfectiemengsel toe aan de 35 millimeter kweekschaal met de cellen. Schud het gerecht voorzichtig zodat het mengsel gelijkmatig verspreid is, en breng het dan terug in de broedmachine.

Voeg 24 uur na transfectie drie milliliter volledig medium DMEM toe, aangevuld met 10% FBS en één keer penicillinestreptomycine aan elke schaal om de proliferatie van getransfecteerde cellen te bevorderen. Op 72 uur na transfectie begint de selectie door G418-antibioticum toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van één milligram per milliliter. Zodra het selectieproces is vastgesteld en het totale celaantal één keer tien keer zes macht, oogst u de cellen door centrifugatie op 300 G gedurende zes minuten bij 25 graden Celsius.

Was de pellet één keer met eenmalig steriel PBS, pH ongeveer 7,4, en centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Na het opnieuw opsuspendelen van de uiteindelijke celpellet in eenmalige PBS, bepaal je de celconcentratie met een hemocytometer. Verdun de suspensie tot één keer 10 met de kracht van zes cellen per milliliter, zodat de cellen volledig opnieuw worden opgehangen, en breng cellen over naar een flowcytometriebuis.

Vervolgens zet je de fluorescentie-geactiveerde celsorter in op single cell mode met een 96-wells tissue cultuurbehandelde plaat als verzamelapparaat. Pas de software-instellingen aan afhankelijk van het gebruikte instrument. Gate de primaire populatie door cellen te selecteren op basis van voorwaartse verstrooiing en zijvervreemding om de verwachte grootte en granulariteit te isoleren.

Sluit afval en sterk korrelige of dode cellen uit, en gebruik voorste verstrooiingsgebied versus hoogte of zijdelings verstrooiingsgebied versus hoogte-plots om singlets te gaten. Vul vervolgens elke put van de 96-put plaat vooraf met 100 microliter volledig medium met één milligram per milliliter G418, en verwarm de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius. Voer celsortering uit in single cell-modus, waarbij de sorteersnelheid onder de 300 gebeurtenissen per seconde blijft om de nauwkeurigheid te verbeteren.

Na sortering inspecteer je elke put onder een microscoop om de aanwezigheid van één cel per put te bevestigen en plaats je de plaat in een incubator van 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Laat de enkelcellige klonen individueel uitzetten in de 96-wellplaat. Zodra klonale groei zichtbaar is, voeg je medium met gereduceerd G418 toe aan de putten tot een uiteindelijke concentratie van 400 microgram per milliliter om de selectiedruk te behouden.

Draag goed groeiende klonen achtereenvolgens over op 12-wellplaten, vervolgens op T25-flessen en tenslotte op T75-flessen indien nodig totdat elke kloon ongeveer één keer 10 bereikt tot de kracht van zes cellen. Verzamel vervolgens dubbelcellige pellets op regelmatige intervallen. Bewaar één pellet bij min 20 graden Celsius voor genomische DNA-extractie.

Homogeniseer een tweede pellet in 500 microliter trizolreagens en bewaar deze bij min 20 graden Celsius voor RNA-extractie en complementaire DNA-synthese. Extractie van genomisch DNA uit geselecteerde klonen met fenol-chloroform-extractie gevolgd door ethanolprecipitatie. Sussen het geëxtraheerde DNA volledig opnieuw in nucleasevrij water of TE-buffer.

Meet de DNA-concentratie en zuiverheid met een spectrofotometer voordat je doorgaat met de downstream-stappen. Ten slotte wordt het totale RNA uit de opgeslagen celpellets geëxtraheerd met behulp van een trizolreagens, gevolgd door isopropanolprecipitatie. Individuele cellen werden gesorteerd in 96-wellplaten met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering om degenen met beide constructies te isoleren.

PCR-analyse van 10 uitgebreide klonen bevestigde dat slechts enkelen beide constructen behielden, wat werd aangegeven door banden van 230 basenparen en 205 basenparen. Pyrosequencing toonde aan dat de positieve clone two verhoogde methylatie vertoonde op meerdere CPG-locaties nabij het gRNA1-doelgebied vergeleken met de niet-transfecteerde controlegroep. We pakken het gebrek aan niet-geïntegreerde langetermijnleveringssystemen aan, waardoor precieze, stabiele epigenetische bewerking mogelijk is zonder het genoom van de gastheer te veranderen.

Onze bevindingen vormen een betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van genregulatie via targetmethylatie en ondersteunen het ontwikkelen van mogelijke precieze epigenetische therapieën. Toekomstig onderzoek zal het verbeteren van episomale afgifte, het minimaliseren van doeleffecten, het verbeteren van de efficiëntie van Cas9 en het aanpassen van het systeem voor primaire of in vivo modellen.