Name: Efficiënte en snelle generatie van CAR-T en cytokine-geïnduceerde killercellen in GMP-schaalbare apparaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer een schaalbare G-Rex-methode voor de expansie van CAR-T- en CIK-cellen in immunotherapie. Dit protocol zorgt voor efficiënte groei met minimale tussenkomst en behoud van celviabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">NK cells for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).</li>
<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+cytokine-induced+killer+cells+overcome+CAR-T+cell+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits.</a> Front Immunol. 14, 1229540(2023).</li>
<li>Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((30+years+of+CIK+cell+therapy%3A+Recapitulating+the+key+breakthroughs+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective.</a> J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).</li>
<li>Bayatipoor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NKT+cells+in+cancer+immunotherapy-from+bench+to+bed%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed.</a> Med Oncol. 40, 29(2022).</li>
<li>Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+by+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy by γδ T cells.</a> Science. 386, 6717(2024).</li>
<li>Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+melanoma%3A+A+viable+treatment+option%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option.</a> J Immunother Cancer. 6, 102(2018).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+The+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+world+of+TCR-T+cell+trials+against+cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review.</a> Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).</li>
<li>Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).</li>
<li>Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors%3A+The+paradigm+of+cytokine-induced+killer+%28CIK%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).</li>
<li>Palmerini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-free+protocol+for+the+ex+vivo+expansion+of+cytokine-induced+killer+cells+using+gas-permeable+static+culture+flasks%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks.</a> Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).</li>
<li>Pietà, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+therapeutic+strategy+for+B-cell+malignancies+that+combines+obinutuzumab+and+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells.</a> J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).</li>
<li>Pievani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+capability+of+CD3%2BCD56%2B+CIK+cells%2C+a+T-cell+subset+that+acquires+NK+function+and+retains+TCR-mediated+specific+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity.</a> Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).</li>
<li>Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+cytokine-induced+killer+cell+activity+by+CD16+engagement+with+clinical-grade+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies.</a> OncoImmunology. 5, e1199311(2016).</li>
<li>Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+and+unmodified+cellular+approaches+to+enhance+graft+versus+leukemia+effect%2C+without+increasing+graft+versus+host+disease%3A+The+use+of+allogeneic+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells.</a> Front Immunol. 15, 1459175(2024).</li>
<li>Rotte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+correlation+for+CAR-T+cells%3A+A+systematic+review+of+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies.</a> J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).</li>
<li>Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+update+of+the+international+registry+on+cytokine-induced+killer+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy.</a> J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).</li>
<li>Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+expansion+in+bioreactors%3A+Upgrading+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy.</a> J Biol Eng. 15, 13(2021).</li>
<li>Smith, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+expansion+in+a+Xuri+Cell+Expansion+System+W25%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25.</a> Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).</li>
<li>Ludwig, J., Hirschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+process+optimization+for+large-scale+CAR+T+expansion+using+the+G-Rex+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform.</a> Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).</li>
<li>Vera, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J Immunother. 33, 305-315 (2010).</li>
<li>Bajgain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+%26%2334%3BM%26%2334%3B+series%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex &#34;M&#34; series.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).</li>
<li>Talleur, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+CD27-depleted+cells+in+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy.</a> Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).</li>
<li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+HER2%2Fneu-specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr-51+release+assay+to+the+xCELLigence+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system.</a> J Vis Exp. (66), e3683(2012).</li>
<li>Eberhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+serum-free+media+on+the+expansion+and+functionality+of+CD19.CAR+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells.</a> Int J Mol Med. 52, 58(2023).</li>
<li>Cadiñanos-Garai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+temporal+mapping+of+CAR+T+cells+reveals+phenotypic+and+functional+remodeling+during+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing.</a> Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).</li>
<li>Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+process+development+of+NK+and+CAR-NK+expansion+in+a+closed+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor.</a> Front Immunol. 15, 1412378(2024).</li>
<li>Noldner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lung+cancer+tumor-infiltrating+lymphocyte+%28TIL%29+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing.</a> Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).</li>
<li>Bandeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+lentiviral+vectors%3A+Releasing+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).</li>
</ol>

Adoptieve celtherapie (ACT) is een belangrijke pijler geworden van geavanceerde therapieën voor kankerbehandeling. Deze aanpak is gebaseerd op het toedienen van ex vivo uitgebreide cellulaire producten om anti-tumor effectiviteitte bereiken 1. Tot nu toe zijn veel celtypen gebruikt in ACT, variërend van antigeen-aspecifieke benaderingen, bijvoorbeeld natuurlijke killer (NK)2, cytokine-geïnduceerde killer (CIK)3,4, natuurlijke killer T (NKT)5, of γδ T-cellen6, tot zeer specifieke en gepersonaliseerde cellen, zoals tumor-infiltrerende lymfocyten (TILs)7 en gemanipuleerde cellengebaseerde therapieën, bijvoorbeeld chimerische antigeenreceptor (CAR)1, 8 en T-cel receptor (TCR) cellen 9,10.
CAR-T-cellen zijn genetisch gemodificeerde T-cellen die worden gegenereerd door ex vivo virale transductie om een synthetische immuunreceptor tot expressie te brengen, ontworpen om een specifiek moleculair doelwit te herkennen. De CAR-structuur bestaat uit een antigeen-specifiek enkelvoudig variabele Fragment (scFv) antilichaam, gecombineerd met intracellulaire signaaldomeinen, waaronder de TCRζ-keten en costimulerende moleculen. Bij antigeenbetrokkenheid levert het intracellulaire domein activatiesignalen af die de proliferatie van T-cellen en antitumoractiviteitbevorderen.
CIK-cellen zijn een heterogene populatie van geactiveerde T-lymfocyten die tijdens ex vivo expansie van CD56 verwerven uit perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) of navelstrengbloed (UCB)12. Deze expansie omvat stimulatie met Interferon-γ (IFN-γ), anti-CD3 monoklonale antilichamen en Interleukine-2 (IL-2), gevolgd door 14 dagen kweek in IL-2. CIK-cellen lijken functioneel op zowel NK- als T-cellen en oefenen antitumoractiviteit uit via zowel major histocompatibility complex (MHC)-onafhankelijke als afhankelijke mechanismen 13,14,15,16. Deze eigenschappen maken het mogelijk om CIK-cellen te gebruiken in zowel allogene als autologe therapeutische omgevingen met minimaal graft-versus-host ziekte (GvHD) risico17.
In de klinische praktijk vereisen zowel CAR-T als CIK-celtherapieën de toediening van grote aantallen cellen. CAR-T-cellen worden geïnfuseerd met 50-200 miljoen doses per patiëntvan 18 jaar. Evenzo worden CIK-cellen doorgaans toegediend in doses tot 10 miljard cellen per infuus, waarbij patiënten vaak meerdere infusen krijgen afhankelijk van het behandelprotocol19. Traditionele celkweekmethoden met kolven of platen zijn inefficiënt, tijdrovend en vereisen frequente overdracht, waardoor grootschalige uitbreiding onhaalbaar wordt en het risico op besmetting toeneemt. Geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde systemen met zakkweken of bioreactoren maken grootschalige uitbreiding mogelijk, maar hebben beperkingen, zoals schuifspanning of de noodzaak van dichtheidsaanpassingen en frequente mediumperfusie 20,21, en het hanteren van één batch tegelijk, wat leidt tot hoge kosten in zowel academische als industriële contexten. In deze uitdagende situatie wordt een alternatief gerepresenteerd door het gaspermeable rapid expansion (G-Rex) apparaat, een statische kweekmethode met een siliciummembraan op de bodem van de put, wat zorgt voor efficiënte zuurstofuitwisseling en een grotere hoogte van de vaten, waardoor een grote volumecapaciteit mogelijk is. Het systeem ondersteunt dus celgroei zonder middelvervanging of dichtheidsaanpassing22,23. G-Rex-M-systemen hebben schaalbaarheid tot 5000 mL aangetoond en zijn compatibel met geautomatiseerde oogstsystemen, waardoor een besmettingsvrij en gesloten kweekplatform wordt geboden dat gemakkelijk vertaalbaar is van academische naar klinische omgevingen voor de ontwikkeling van geavanceerde geneesmiddelen (ATMP's).
In de beschreven procedure hebben we de voordelen en eigenschappen van G-Rex-apparaten benut om het uitbreidingsprotocol van zowel CAR-T als CIK-cellen te optimaliseren. We toonden aan dat beide celtypen efficiënt kunnen worden uitgebreid en opgeschaald, waarbij een consistent fenotype en functioneel profiel behouden blijven over verschillende kweeksystemen. Een schematisch overzicht van het expansieprotocol voor zowel CIK- als CAR-T-cellen is weergegeven in Figuur 1.
<img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figuur 1: Overzicht van CAR-T en CIK celexpansieprotocollen met gebruik van G-24 of G-6M kweekapparaten. CAR-T en CIK-cellen worden vanaf dag 0 uit geïsoleerde PBMC's geëxplodeerd. Voor de uitbreiding van CAR-T-cellen worden PBMC's op dag 1 gestimuleerd met anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen, genetisch gemodificeerd op dag 2, en vervolgens gekweekt met hIL-7 en hIL-15 suppletie elke 3-4 dagen, met de laatste oogst voor functionele assays op dag 9. In het G-6M-formaat is cytokinesuppletie beperkt tot dag 2, zonder extra cytokinevoeding gedurende de kweekperiode. Voor de uitbreiding van CIK-cellen worden PBMC's op dag 1 gestimuleerd met rhIFN-γ en op dag 2 met anti-CD3-antistoffen en rhIL-2, die vervolgens elke 3-4 dagen worden toegediend. Bij G-24 is een mediumverandering vereist gelijktijdig met het cytokinesupplement. CIK-cellen worden op dag 14 geoogst voor latere functionele assays. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD28 Antibody, anti-human</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-375</td><td>Clone 15E8</td></tr><tr><td>CD3 Antibody, anti-human</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-387</td><td>Clone OKT3</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>740147</td><td>Clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD314 APC (NKG2D)</td><td>Biolegend</td><td>320808</td><td>Clone 1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>563875</td><td>Clone SK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>563429</td><td>Clone HI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>Biolegend</td><td>318306</td><td>Clone HCD56</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555543</td><td>Clone FREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BD Biosciences</td><td>562428</td><td>Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>E-plate 16</td><td>Agilent</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), Value</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain 780 (FVS780)</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 24 Well Plate&nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 6M Well Plate&nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Lonza</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>His Antibody</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>Human Albumin 20%</td><td>CSL Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human IL-15 Recombinant Protein</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-7 Recombinant Protein</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Borstkankercel lijn&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Physiological solution (0.9% Sodium Chloride)</td><td>Monico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protamine Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Burkitt's lymfoomcel lijn&nbsp;</td></tr><tr><td>Recombinant Human IFN-gamma</td><td>R&amp;D Systems</td><td>285-IF-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant IL-2 (Proleukin)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-His</td><td>Invitrogen</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>Stable L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-Blue solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td><td>Lonza</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

efficiënte en snelle generatie van car-t en cytokine-geïnduceerde killercellen in gmp-schaalbare apparaten

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

Het hier beschreven protocol biedt een efficiënte en robuuste workflow voor de ex vivo uitbreiding en engineering van effectorcellen uit geïsoleerde PBMC's, namelijk CAR-T en CIK-cellen. Deze methode vereist minimale celmanipulatie en maakt gebruik van de gasuitwisselingscapaciteit van G-Rex-apparaten, waardoor ze een superieure beschikbaarheid van voedingsstoffen en zuurstofvoorziening bieden ten opzichte van conventionele statische kweeksystemen23,24. Een belangrijk voordeel van dit protocol is de inherente schaalbaarheid van kleinschalige 24-well apparaten (G-24), geschikt voor preklinische studies, tot grotere 6M-apparaten (G-6M), compatibel met translationele of klinische productiebehoeften, zonder dat er andere wijzigingen in het protocol nodig zijn dan proportionele schaal.
Met dit protocol werden zowel CAR-T als CIK-cellen succesvol parallel uitgebreid vanuit gezonde donor PBMC's in G-24 en G-6M formaten, zoals beschreven in secties 2-4. Aan het einde van de kweekperiode vertoonden beide celtypen een hoge vouwexpansie en levensvatbaarheid, met vergelijkbare proliferatie tussen de twee apparaatformaten (Figuur 2, Aanvullende Tabel 1, Aanvullende Tabel 2), wat de reproduceerbaarheid van het protocol over verschillende kweekschalen benadrukt.
Om de schaalbaarheid van de kweekapparaten te valideren, werden effectorcellen fenotypisch en functioneel verder gekarakteriseerd. Voor de CD19 CAR-T-cellen hebben we de CAR-expressie gekwantificeerd en de CD4+ en CD8+ subsets geëvalueerd, waarbij we een overwicht van CD19 CAR+ CD8+ T-cellen noteerden (Figuur 3A-B, Aanvullende Tabel 1). Voor CIK-cellen beoordeelden we de frequentie van T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) en CIK (CD3+CD56+) populaties (Figuur 3D), evenals de expressie van de activerende receptor NKG2D (Figuur 3E, Aanvullende Tabel 2). Bovendien observeerden we vergelijkbare fenotypes en expressie van specifieke populatiemarkers tussen de G-24- en G-6M-kweekformaten voor zowel CAR-T- als CIK-cellen. De differentiatiestatus van zowel CD19 CAR-T als CIK-celproducten werd geanalyseerd met CD62L- en CD45RA-kleuring (Figuur 3C-F, Aanvullende Tabel 1, Aanvullende Tabel 2), waarbij vergelijkbare geheugen- en effectorfenotypes tussen cellen gekweekt in G-24- en G-6M-formaten aan het licht kwamen. Deze bevindingen tonen aan dat het opschalen van het proces de fenotypische integriteit of differentiatiestatus van de uitgebreide effectorcelpopulaties niet aantast.
Tot slot, om de functionele potentie te evalueren, gebruikten we doelspecifieke cytotoxiciteitsassays. Zowel CD19 CAR-T als CIK-cellen die in een van beide apparaten expandeerden, vertoonden krachtige cytolytische activiteit, wat het behoud van functionele eigenschappen over de hele schaal bevestigt (Figuur 4). Al met al ondersteunen deze resultaten de geschiktheid van de uitgebreide producten voor latere toepassingen in preklinische modellen en mogelijk klinische tests.
<img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figuur 2: Proliferatie en levensvatbaarheid van CD19 CAR-T en CIK-cellen. CAR-T-cellen (n = 5) en CIK-cellen (n = 6) die uit PBMC's in G-24- en G-6M-platen zijn uitgebreidd, werden respectievelijk op dag 9 en dag 14 van de expansie verzameld om celtelling en evaluatie van de (A-C) vouwtoename en (B-D) percentage van levensvatbare cellen uit te voeren. Histogrammen geven de gemiddelde expressie ± standaarddeviatie (SD) weer en stippen geven enkele donoren aan (zie Aanvullende Tabel 1 en Aanvullende Tabel 2 voor individuele waarden). De gegevens werden geanalyseerd met een tweezijdige meervoudige paarige t-test (A-C) of meervoudige tweezijdige Wilcoxon matched-pairs rangtest (B-D), met Holm-Sidak-correctie voor meervoudige vergelijkingen (*p &lt; 0,05). Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figuur 3: Beoordeling van het fenotype van CD19 CAR-T en CIK cellen uitgebreid in G-24 en G-6M apparaten. De expressie van CAR-moleculen op CD19 CAR-T-cellen (n = 5) werd geanalyseerd met flowcytometrie om (A) de transductie-efficiëntie in G-24- en G-6M-expansieprotocollen te beoordelen, evenals de expressie van (B) CD4+/CD8+ en (C) naïeve/geheugensubpopulaties in de CD3+CAR+-subset. Het fenotype van bulk CIK-cellen (n = 6) werd geanalyseerd met flowcytometrie om (D) het percentage CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) en T (CD3+CD56-), evenals de expressie van (E) NKG2D en (F) naïeve/geheugensubpopulatie in de CD3+CD56+ subset (G-24 n=5, G-6M n=6) te onderzoeken. Naïef (CD45RA+CD62L+), centraal geheugen (CM, CD45RA-CD62L+), effectorgeheugen (EM, CD45RA-CD62L-), en effectorgeheugen CD45RA-positief (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogrammen geven de gemiddelde expressie ± SD weer en stippen geven enkele donoren aan (zie Aanvullende Tabel 1 en Aanvullende Tabel 2 voor individuele waarden). De gegevens werden geanalyseerd met een tweezijdige meervoudige gepaarde t-test (B-C-D-F) of tweezijdige Wilcoxon matched rank test (A-E), met Holm-Sidak correctie voor meervoudige vergelijkingen (*p &lt; 0,05). Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figuur 4: Evaluatie van CD19 CAR-T en CIK-cel cytotoxiciteit. (A) Specifieke lyse van CD19 CAR-T-cellen (oranje, n = 5) of niet-transduceerde (UTD) cellen (grijs, n = 5) tegen de Burkitt's lymfoom Raji-cellijn (als een suspensiecellijnmodel) werd uitgevoerd door een 6 uur durende flowcytometrie-gebaseerde dodelijke assay. De resultaten worden weergegeven als de gemiddelde specifieke lyse ± SD. (B) De cytotoxiciteit van CIK-cellen gekweekt in G-24 (lichtblauw, n = 7) of G-6M (donkerblauw, n=6) tegen de borstkanker MCF-7 cellijn (als een adherent cellijnmodel) werd elke 15 minuten over 24 uur gemonitord met een realtime celanalyzer. De resultaten worden weergegeven als de gemiddelde specifieke lysis ± SEM. De gegevens werden geanalyseerd met de Mann-Whitney test, Holm-Sidak correctie voor meervoudige vergelijkingen (*p &lt; 0,05). Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende Figuur 1: Gate-strategie gebruikt voor flowcytometrie-analyses. Representatieve grafieken die de gatingstrategieën illustreren voor (A) CAR-T-cel en (B) CIK celfenotypische karakterisering, en (C) fluorescerende cel kleurstof-gebaseerde cytotoxiciteitsassay. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende Tabel 1: Groei, levensvatbaarheid en fenotype van CD19 CAR-T celculturen van individuele donoren. Totaal aantal cellen, vouwtoename, levensvatbaarheid en fenotypische karakterisering van CD19-CAR T-cellen die op dag 9 van de kweek zijn geoogst in G-24- en G-6M-apparaten, worden voor elke donor getoond. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende Tabel 2: Groei, levensvatbaarheid en fenotype van CIK-celculturen van individuele donoren. Totaal celaantal, vouwtoename, levensvatbaarheid en fenotypische karakterisering van CIK-cellen die op dag 14 van de kweek zijn geoogst in G-24- en G-6M-apparaten worden getoond voor elke donor. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">hier om dit bestand te downloaden.</a>

Efficiënte en snelle generatie van CAR-T en cytokine-geïnduceerde killercellen in GMP-schaalbare apparaten

Adoptive cell therapies (ACT) have progressed rapidly in recent years, playing a pivotal role in cancer immunotherapy and significantly influencing ...

efficient-rapid-generation-car-t-cytokine-induced-killer-cells-gmp

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

De lymfodeletieve en immunomodulerende effecten van chemotherapie en stralingsstandaardzorg kunnen worden benut om de antitumor-effectiviteit van T-celimmunotherapie te verbeteren. We schetsen een methode voor het genereren van EGFRvIII-specifieke chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen en het toedienen ervan in de context van glioblastoma standaardzorg.

Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care

Het doel van dit protocol is om pathogeen-specifieke klinische graad T-cellen te produceren met behulp van een tafelblad, geautomatiseerde, tweede generatie celverrijkingsapparaat dat een gesloten cytokine-opvangsysteem bevat en geen toegewijd personeel of gebruik van een GMP-faciliteit vereist. De gegenereerde cytomegalovirus pp65-specifieke T-cellen kunnen direct aan patiënten worden toegediend.

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

Hier presenteren we een protocol voor genetisch gemodificeerde CAR-T cellen via een CRISPR/Cas9 systeem.

CRISPR/Cas9 gebruiken om GM-CSF uit te nemen in CAR-T-cellen

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Gepresenteerd is een protocol voor de uitbreiding van Gamma-Delta (γδ) T-cel geneesmiddel product. Lymfocyten worden geïsoleerd door elutriatie en γδ-verrijkt met zoledroninezuur en interleukine-2. Alfa-bèta T-cellen worden uitgeput met behulp van een magnetisch scheidingsapparaat van klinische kwaliteit. De γδ-cellen worden samen met K562-afgeleide, kunstmatige antigeen-presenterende cellen en uitgebreid.

Uitbreiding en verrijking van gamma-delta (γδ) T-cellen uit ontfereend menselijk product

Dit protocol schetst het proces van het transduceren van primaire menselijke T-cellen met een gen van belang, waardoor compatibiliteit met Good Manufacturing Practice (GMP)-normen wordt gegarandeerd.

Een GMP-conforme procedure voor het genereren van gengemodificeerde T-cellen

Dit artikel beschrijft het productieproces voor chimere antigeenreceptor-T-cellen voor klinisch gebruik, met name met behulp van een geautomatiseerde celprocessor die virale transductie en kweek van T-cellen kan uitvoeren. We geven aanbevelingen en beschrijven valkuilen waarmee rekening moet worden gehouden tijdens de procesontwikkeling en implementatie van een klinische studie in een vroege fase.

Chimere antigeenreceptor T-celproductie op een geautomatiseerde celprocessor

Dit protocol stroomlijnt de productie van retrovirale vectoren en de transductie van T-cellen bij muizen, waardoor de efficiënte generatie van CAR-T-cellen van muizen wordt vergemakkelijkt.

Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Er is een gedetailleerd protocol voorzien voor het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie om zeer efficiënte, gerichte knock-in van grote, multicistronische constructies in primaire menselijke T-cellen te bereiken via de homologie-gemedieerde eindjoining (HMEJ) DNA-reparatieroute. T-cellen die met dit cGMP-aanpasbare protocol zijn ontwikkeld, behouden een uitstekende celexpansie, cytotoxiciteit en cytokineproductie.

Niet-virale engineering van primaire menselijke T-cellen via homologie-gemedieerde end-joining gerichte integratie van grote DNA-sjablonen

Leer een schaalbare G-Rex-methode voor de expansie van CAR-T- en CIK-cellen in immunotherapie. Dit protocol zorgt voor efficiënte groei met minimale tussenkomst en behoud van celviabiliteit.

Efficiënte en snelle generatie van CAR-T en cytokine-geïnduceerde killercellen in GMP-schaalbare apparaten

Meer video's verkennen