Lokalisatie van plasmamembraan en intracellulaire neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van kwantitatieve beeldvorming in zoogdiercellen

Het begrijpen van de handel van nicotinische acetylcholinereceptoren naar zoogdierplasmamembranen is cruciaal voor het onderzoeken van chaperon-gemedieerde regulatie en het evalueren van doelselectieve therapieën. Een belangrijk voordeel van pH-gevoelige probes in combinatie met live cell confocale microscopie is de hoge ruimtelijke resolutie van subeenheidlocatie. Om te beginnen, verwarm de reagentia tot 37 graden Celsius.

Ontdooi de nAChR-subunit DNase volledig en breng het transfectie-reagens naar kamertemperatuur. Maak alle reagentia schoon met 70% ethanol voordat je ze in de bioveiligheidskast plaatst. Om alfa-7 nAChR's tot expressie te brengen, verdun je in een microcentrifugebuis alfa-7 en NACHO plasmide DNase tot een gereduceerd serummedium.

Meng voorzichtig door te pipetteren na DNA-toevoeging. Alternatief, om alfa-4 beta-2 receptoren tot expressie te brengen, verdun je 4 microgram van elke subeenheid-DNA tot in totaal 250 microliter gereduzeerd serummedium en meng het voorzichtig. Pas de subeenheidverhoudingen aan om de expressie van specifieke receptorisoformen te optimaliseren.

Voor alfa-4 beta-2 receptoren met een extra plasmide, voeg gelijke hoeveelheden van elk plasmide-DNA toe. Verdunn vervolgens in een nieuwe microcentrifugebuis 8 microliter transfectiereagens druppelgewijs tot 250 microliter gereduceerd serummedium. Na een incubatie van 5 minuten bij kamertemperatuur, combineer je de verdunde DNase met het verdunde transfectiereagens druppelwijs in een buis.

Meng voorzichtig door te pipetten en incubeer 20 minuten op kamertemperatuur. Terwijl complexen ontstaan, vervang het medium in de kweekschalen door 1 milliliter serumvrije EMEM. Voeg druppelwijs 500 microliter van het DNA-transfectie-reagenscomplex toe aan elk gerecht.

Meng voorzichtig door het bord te wiebelen zodat het gelijkmatig verdeelt, vooral over de glasbodem. Incubeer de plaat 24 uur op 37 graden Celsius en vervang het medium na 4-6 uur. Verwijder het oude medium door te zuigen.

Spoel het gerecht drie keer af met twee milliliter PBS gedurende elk 10 minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 2 milliliter pH 7,4 beeldvormingsbuffer toe aan de schaal. Plaats de schotel in de glaashouder van een confocale microscoop en plaats deze in de voorverwarmde omgevingskamer.

Verbind de buis van de peristaltische pomp met de houder voor de beeldvorming en sluit de omgevingskamer. Start nu de beeldvormingssoftware en selecteer lasers voor de fluoroforen van interesse. Scan de schotel om cellen te lokaliseren voor beeldvorming met een 10-60 x objectief.

Verhoog de vergroting indien gewenst en pas de scherptescherpte aan indien nodig. Selecteer de voorkeursresolutie en maak één afbeelding met het gewenste objectief. Noteer de locatie op de schotelkaart om dezelfde cellen na bufferwissel te verplaatsen.

Herhaal beeldvorming voor verschillende gebieden op de schotel met dezelfde opname-instellingen voor alle beelden. Houd alleen de uitlaatleiding aangesloten op de peristaltische pomp, zuig langzaam de pH 7,4 buffer uit de schaal in een afvalcontainer. Vervolgens zet je de inlaatleiding over op de pH 5,5 afkoelbuffer.

Zet de peristaltische pomp in om pH 5,5 buffer toe te voegen met een debiet van 1,5 milliliter per minuut, zodat de cellen aan elkaar blijven zitten. Na 20 minuten zet je de pomp uit en breng je de cellen nog eens 20 minuten in de buffer om evenwicht te creëren. Na de incubatie herhaal je beeldvorming van de opgeslagen locaties.

Om te beginnen met beeldkwantificatie, open je ImageJ en laad je de te analyseren afbeelding. De afbeelding zal verschijnen als een stapel waarbij elk vastgelegd kanaal in hetzelfde frame wordt weergegeven. Navigeer naar het fasekanaal.

Als het beeld te fel lijkt, selecteer dan Proces en kies Contrast verbeteren en klik dan op OK. Gebruik het vergrootglas om in te zoomen op één cel. Gebruik het vrijhandse selectiegereedschap om de omtrek van de cel in het fasekanaal te traceren. Schakel dan over naar het fluorescerende kanaal dat overeenkomt met de fluorofoor van interesse.

Stel de gewenste metingen in door Analyseren te selecteren en op Metingen instellen te klikken. Zorg ervoor dat Area, Mean gray value en Integrated density worden gecontroleerd. Om het geselecteerde gebied te meten, kies je Analyseren en klik je vervolgens op Meten.

Neem drie achtergrondmetingen door lege gebieden nabij de geselecteerde cel te traceren. Na het uitvoeren van metingen voor alle gewenste cellen, kopieer en plak je de meetgegevens in Excel voor analyse. Bereken vervolgens het gemiddelde achtergrondgemiddelde uit de drie achtergrondmetingen.

Bereken de gecorrigeerde totale celfluorescentie of CTCF-waarde voor elke cel met behulp van de gegeven formule. Met dezelfde workflow analyseer je afbeeldingen die na bufferwijziging zijn verkregen. Exporteer alle resultaten naar data-analysesoftware voor statistische verwerking.

Zwakke alfa-BTX AF647-kleuring werd waargenomen in niet-getransfecteerde N2a-cellen, terwijl robuuste punctate-labeling werd gedetecteerd in cellen die getransfecteerd waren met alfa-7 DNA. Kwantificatie bevestigde dat plasmamembraanexpressie van alpha-7 nAChRs significant hoger was in alpha-7 getransfecteerde N2a-cellen dan in niet-getransfecteerde controlegroepen. Bij pH 7,4 was totale alpha-7 pHuji-fluorescentie zichtbaar bij het plasmamembraan.

in getransfecteerde N2a-cellen. Bij pH 5,5 was de fluorescentie van alpha-7 pHuji verminderd, wat interne receptorlokalisatie onthulde. De externe fluorescentie van de alpha-7 pHuji-receptor was verantwoordelijk voor het grootste deel van de receptorexpressie.

Kwantificering toonde aan dat 82,6% van de alpha-7 pHuji-receptoren zich op het plasmamembraan bevond, terwijl 17,4% intern was. De fluorescentie werd hersteld bij terugkeer naar pH 7,4, wat de omkeerbaarheid van het pHuji-signaal bevestigde. Bij pH 7,4 vertoonden N2a-cellen die alfa-4 SEP en bèta-2 pHuji expressie hebben robuuste membraanfluorescentie voor beide subunits.

Bij pH 5,5 werd fluorescentie afgekoeld, wat wijst op interne lokalisatie van sommige alfa-4 SEP- en bèta-2 pHuji-subunits. Kwantificering toonde aan dat 76,5% van de alfa-4 SEP zich bij het plasmamembraan bevond, en 23,4% intern. In drievoudig getransfecteerde cellen vertoonde alfa-4 SEP 82,8% membraanlokalisatie en 17,2% interne expressie.

In dezelfde cellen was 63,4% van de bèta-2 pHuji-subunits gelokaliseerd op het membraan, terwijl 36,6% intracellulair was. Met behulp van het gepresenteerde protocol karakteriseerden we nieuwe chaperoneffecten op de expressie en transport van nicotinereceptoren, en evalueerden we nieuwe doelselectieve therapieën. Een voordeel van ons protocol is de aanpassingskracht voor homomere en heteromere nicotinereceptoren, waardoor de relatieve cellulaire locatie gekwantificeerd kan worden.

Onze aanpak maakt snelle, robuuste expressie van nicotinereceptorplasmamembraan mogelijk, wat chaperon-gemedieerde trafficking-analyse en geneesmiddelenontdekking ondersteunt.