Generatie van een model gebaseerd op een muisprostaatorganoïde voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties

Dit onderzoek richt zich op het begrijpen hoe bacteriële pathogenen het prostaatepitheel infecteren en welke interacties tussen gastheerpathogenen de infectie bepalen. Bestaande in vitro modellen legden de prostaatepitheeldiversiteit slecht vast. Dit model biedt een fysiologisch relevant systeem dat de verschillende celtypen in het weefsel weerspiegelt.

Om te beginnen verkrijg je driedimensionale muisprostaatorganoïden gekweekt op druppels extracellulaire matrix in een 24-wells plaat. Aspiraat het medium uit het gewenste aantal putten en voeg 500 microliter verse kweekmedium toe aan elke put. Met behulp van een P 1000-pipet wordt de extracellulaire matrixval in elke put mechanisch verstoord.

Verzamel deze suspensie in een 15-milliliter conische buis met niet meer dan twee putten per buis. Voeg vers kweekmedium toe om het volume op 10 milliliter te brengen. Draai de buis voorzichtig drie tot vier keer om te mengen en centrifugeer op 450 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Aspireer het supernatant. Susselt de pellet opnieuw in twee milliliter enzymoplossing, verwarm het voor tot 37 graden Celsius en incubeer de suspensie in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Gebruik een P 1000 pipet, meng de celsuspensie elke vijf minuten tijdens de incubatie.

Voeg na de incubatie verse kweekmedium toe om een eindvolume van 10 milliliter te bereiken. Draai de buis voorzichtig drie tot vier keer om te mengen om te mengen. Centrifugeer op 450 G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius.

Aspiraat het supernatant zonder de pellet te verstoren. Suspendeer de pellet opnieuw in 300 microliter kweekmedium aangevuld met een 10 micromolaire gesteente-remmer. Met behulp van een Neubauer-telkamer telt je de cellen in de suspensie.

Verdun de suspensie tot een concentratie van 62.500 cellen per milliliter in kweekmedium aangevuld met een 10 micromolaire gesteente-remmer. Vervolgens zaad je 200 microliter van de suspensie per put voor een plaat met 48 putten en 300 microliter per put voor gekamerde microslides. Incubeer de platen in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Controleer na één dag of de meeste losse cellen aan het tweedimensionale kweekoppervlak zijn gehecht. Vervang het kweekmedium elke twee tot drie dagen en zet de kweek voort totdat de samenvloeiing binnen zeven dagen is bereikt. Om differentiatie te induceren om luminale cellen te verrijken, voeg je tijdens het zaaien 10 nanomolaren van vijf alfa-dihydrotestosteron of DHT toe aan de celsuspensie.

Streep de uropathogene Escherichia coli-stam, of UPEC, op een LB-agarplaat aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline. Bred de plaat uit bij 37 graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur. Met behulp van een steriele lusinoculatie Drie milliliter LB-bouillon aangevuld met 100 microgram ampicilline per milliliter met één bacteriële kolonie.

Breng de cultuur statisch uit bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur. Vortex de nachtelijke bacteriële cultuur. Meet de optische dichtheid van de cultuur op 600 nanometer.

Bereken vervolgens het volume cultuur dat nodig is om een startoptische dichtheid van 0,05 in drie milliliter bouillon te bereiken. Voeg het berekende volume bacteriecultuur toe aan verse met ampicilline aangevuld LB-bouillon. Incubeer statisch bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.

Na de incubatie vortex je de bacteriële cultuur. Meet de optische dichtheid op 600 nanometer. Bereken het kweekvolume dat nodig is om een optische dichtheid van één te bereiken.

Centrifugeer het benodigde volume op 12.000 G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Aspireer en gooi het supernatant weg. Suspendeer de bacteriële pellet opnieuw in één milliliter primus en vrij organoïde kweekmedium zonder DHT.

Verdunn vervolgens de suspensie met een muizenprostaat-organoïde kweekmedium om een multipatie van infectie van 100 te bereiken. Aspireer het kweekmedium uit het voorbereide organoïde-gebaseerde model. Voeg 200 microliter kweekmedium met bacteriën toe aan elke put van een plaat met 48 putten.

Incubeer één uur in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Aspiraat het bacteriehoudende medium uit de putten en was de putten drie keer met een vers kweekmedium om extracellulaire bacteriën te verwijderen. Voeg vervolgens een kweekmedium toe met 50 microgram per milliliter gentamycine en laat het 30 minuten incuberen.

Aspireer het medium. Voeg verse kweekmedium toe, aangevuld met 10 microgram per milliliter gentamycine voor de resterende infectietijd. Gebruik een confocale microscoop om de geïnfecteerde cellen na fluorescerende kleuring te fotograferen en kwantificeer geïnfecteerde cellen met een flowcytometer.

In de controleconditie zonder dihydrotestosteron waren de meeste cellen cytokeratine, vijf positieve basale cellen, met slechts enkele die een lage CD 24 8 luminale expressie vertoonden. Aanvulling met één nanomolaire DHT leverde gemengde basale luminale populaties op, hoewel CD 24 A laag bleef. Het verhogen van DHT naar 10 nanomolaire bevorderde de differentiatie in luminale cellen, terwijl sommige basale cellen na zeven dagen kweek behouden bleven.

Dit correleerde met kwantificatiestudies die een afname van cytokeratine vijf positieve basale cellen en een toename van CD 24A positieve luminale cellen met toenemende DHT-concentratie in de loop van de tijd aantoonden. Op nul uur na infectie hechtte UPEC zich in grote aantallen aan epitheelcellen. Na een uur gentamycinebehandeling daalde het aantal UPEC-positieve cellen sterk.

Na 24 uur waren de geïnfecteerde celaantallen vergelijkbaar met die van één uur. Confocale beeldvorming na 24 uur toonde aan dat intracellulaire bacteriën bleven repliceren en gemeenschapsachtige clusters vormden. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de dynamiek van bacteriële infecties en die interacties tussen pathogeen te bestuderen in een model dat de epitheelcellulaire diversiteit behoudt.

Toekomstige studies kunnen dit model gebruiken om diverse prostaataandoeningen te onderzoeken, waaronder infecties, kankerbiologie, en potentiële therapeutische verbindingen te testen.