Generatie van een model gebaseerd op een muisprostaatorganoïde voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties
February 27th, 2026
Dit protocol beschrijft de generatie van een muisprostaat-organoïde-gebaseerd model dat in 2D is gekweekt. Het omvat organoïde dissociatie, celzaadvorming, differentiatie, beoordeling van de epitheelintegriteit en in-vitro infectie met uropathogene Escherichia coli. Het model biedt apicale toegankelijkheid en is geschikt voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties, waarmee het beperkingen van traditionele 3D-organoïde systemen overwint.
Dit onderzoek richt zich op het begrijpen hoe bacteriële pathogenen het prostaatepitheel infecteren en welke interacties tussen gastheerpathogenen de infectie bepalen. Bestaande in vitro modellen legden de prostaatepitheeldiversiteit slecht vast. Dit model biedt een fysiologisch relevant systeem dat de verschillende celtypen in het weefsel weerspiegelt.
Om te beginnen verkrijg je driedimensionale muisprostaatorganoïden gekweekt op druppels extracellulaire matrix in een 24-wells plaat. Aspiraat het medium uit het gewenste aantal putten en voeg 500 microliter verse kweekmedium toe aan elke put. Met behulp van een P 1000-pipet wordt de extracellulaire matrixval in elke put mechanisch verstoord.
Verzamel deze suspensie in een 15-milliliter conische buis met niet meer dan twee putten per buis. Voeg vers kweekmedium toe om het volume op 10 milliliter te brengen. Draai de buis voorzichtig drie tot vier keer om te mengen en centrifugeer op 450 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Aspireer het supernatant. Susselt de pellet opnieuw in twee milliliter enzymoplossing, verwarm het voor tot 37 graden Celsius en incubeer de suspensie in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Gebruik een P 1000 pipet, meng de celsuspensie elke vijf minuten tijdens de incubatie.
Voeg na de incubatie verse kweekmedium toe om een eindvolume van 10 milliliter te bereiken. Draai de buis voorzichtig drie tot vier keer om te mengen om te mengen. Centrifugeer op 450 G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius.
Aspiraat het supernatant zonder de pellet te verstoren. Suspendeer de pellet opnieuw in 300 microliter kweekmedium aangevuld met een 10 micromolaire gesteente-remmer. Met behulp van een Neubauer-telkamer telt je de cellen in de suspensie.
Verdun de suspensie tot een concentratie van 62.500 cellen per milliliter in kweekmedium aangevuld met een 10 micromolaire gesteente-remmer. Vervolgens zaad je 200 microliter van de suspensie per put voor een plaat met 48 putten en 300 microliter per put voor gekamerde microslides. Incubeer de platen in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.
Controleer na één dag of de meeste losse cellen aan het tweedimensionale kweekoppervlak zijn gehecht. Vervang het kweekmedium elke twee tot drie dagen en zet de kweek voort totdat de samenvloeiing binnen zeven dagen is bereikt. Om differentiatie te induceren om luminale cellen te verrijken, voeg je tijdens het zaaien 10 nanomolaren van vijf alfa-dihydrotestosteron of DHT toe aan de celsuspensie.
Streep de uropathogene Escherichia coli-stam, of UPEC, op een LB-agarplaat aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline. Bred de plaat uit bij 37 graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur. Met behulp van een steriele lusinoculatie Drie milliliter LB-bouillon aangevuld met 100 microgram ampicilline per milliliter met één bacteriële kolonie.
Breng de cultuur statisch uit bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur. Vortex de nachtelijke bacteriële cultuur. Meet de optische dichtheid van de cultuur op 600 nanometer.
Bereken vervolgens het volume cultuur dat nodig is om een startoptische dichtheid van 0,05 in drie milliliter bouillon te bereiken. Voeg het berekende volume bacteriecultuur toe aan verse met ampicilline aangevuld LB-bouillon. Incubeer statisch bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.
Na de incubatie vortex je de bacteriële cultuur. Meet de optische dichtheid op 600 nanometer. Bereken het kweekvolume dat nodig is om een optische dichtheid van één te bereiken.
Centrifugeer het benodigde volume op 12.000 G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Aspireer en gooi het supernatant weg. Suspendeer de bacteriële pellet opnieuw in één milliliter primus en vrij organoïde kweekmedium zonder DHT.
Verdunn vervolgens de suspensie met een muizenprostaat-organoïde kweekmedium om een multipatie van infectie van 100 te bereiken. Aspireer het kweekmedium uit het voorbereide organoïde-gebaseerde model. Voeg 200 microliter kweekmedium met bacteriën toe aan elke put van een plaat met 48 putten.
Incubeer één uur in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Aspiraat het bacteriehoudende medium uit de putten en was de putten drie keer met een vers kweekmedium om extracellulaire bacteriën te verwijderen. Voeg vervolgens een kweekmedium toe met 50 microgram per milliliter gentamycine en laat het 30 minuten incuberen.
Aspireer het medium. Voeg verse kweekmedium toe, aangevuld met 10 microgram per milliliter gentamycine voor de resterende infectietijd. Gebruik een confocale microscoop om de geïnfecteerde cellen na fluorescerende kleuring te fotograferen en kwantificeer geïnfecteerde cellen met een flowcytometer.
In de controleconditie zonder dihydrotestosteron waren de meeste cellen cytokeratine, vijf positieve basale cellen, met slechts enkele die een lage CD 24 8 luminale expressie vertoonden. Aanvulling met één nanomolaire DHT leverde gemengde basale luminale populaties op, hoewel CD 24 A laag bleef. Het verhogen van DHT naar 10 nanomolaire bevorderde de differentiatie in luminale cellen, terwijl sommige basale cellen na zeven dagen kweek behouden bleven.
Dit correleerde met kwantificatiestudies die een afname van cytokeratine vijf positieve basale cellen en een toename van CD 24A positieve luminale cellen met toenemende DHT-concentratie in de loop van de tijd aantoonden. Op nul uur na infectie hechtte UPEC zich in grote aantallen aan epitheelcellen. Na een uur gentamycinebehandeling daalde het aantal UPEC-positieve cellen sterk.
Na 24 uur waren de geïnfecteerde celaantallen vergelijkbaar met die van één uur. Confocale beeldvorming na 24 uur toonde aan dat intracellulaire bacteriën bleven repliceren en gemeenschapsachtige clusters vormden. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de dynamiek van bacteriële infecties en die interacties tussen pathogeen te bestuderen in een model dat de epitheelcellulaire diversiteit behoudt.
Toekomstige studies kunnen dit model gebruiken om diverse prostaataandoeningen te onderzoeken, waaronder infecties, kankerbiologie, en potentiële therapeutische verbindingen te testen.
Overview
This article presents a step-by-step protocol for generating a two-dimensional (2D) culture model derived from mouse prostate organoids. The model maintains key epithelial characteristics and allows direct access to the apical surface, enabling detailed studies of host-pathogen interactions, particularly with uropathogenic Escherichia coli (UPEC). The protocol includes organoid dissociation, cell seeding, differentiation, and infection procedures, validated by immunofluorescence and functional assays.
Key Study Components
Area of Science
- Prostate epithelial biology
- Host-pathogen interactions
- Organoid and cell culture models
Background
- Prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia, prostatitis, and prostate cancer are prevalent in aging men.
- Organoid models replicate epithelial structure and function but limit access to the apical surface.
- Existing in vitro models do not fully capture the diversity of prostatic epithelial cells.
- Improved models are needed to study infection dynamics and disease mechanisms.
Purpose of Study
- To develop a physiologically relevant 2D culture system from mouse prostate organoids.
- To enable direct experimental access to the apical surface for infection studies.
- To validate the model's epithelial diversity and suitability for host-pathogen interaction research.
Methods Used
- Dissociation of mature mouse prostate organoids cultured in extracellular matrix.
- Seeding of dissociated cells onto 2D culture surfaces with optimized conditions for attachment and proliferation.
- Differentiation induction using dihydrotestosterone (DHT) supplementation.
- Infection of the 2D model with UPEC and analysis via immunofluorescence microscopy, TEER measurements, and flow cytometry.
Main Results
- The 2D model retained essential epithelial characteristics and cellular diversity.
- DHT supplementation modulated the balance between basal and luminal cell populations.
- UPEC adhered to and invaded epithelial cells, forming intracellular clusters observed by confocal microscopy.
- Gentamycin treatment effectively reduced extracellular bacteria, allowing study of intracellular infection dynamics.
Conclusions
- The 2D organoid-derived model provides a robust platform for studying prostate epithelial biology and host-pathogen interactions.
- It enables detailed investigation of infection dynamics and cellular responses.
- The model is suitable for future studies on prostate diseases and therapeutic testing.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Prostate organoid-derived 2D models address a critical gap in preclinical research by enabling direct interrogation of host-pathogen interactions at the epithelial barrier. This system preserves cellular diversity and barrier function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for infection and prostate disease research. The platform's translational relevance positions it as a reusable asset for portfolio-wide evaluation of disease mechanisms and therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of epithelial responses to uropathogenic Escherichia coli infection.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a physiologically relevant context.
- Facilitates biological de-risking by modeling both basal and luminal cell populations.
- Improves predictive confidence for downstream infection biology studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible 2D epithelial system for quantitative infection assays.
- Enables direct access to the apical surface for compound or pathogen application.
- Supports TEER and immunofluorescence-based readouts for barrier integrity and cell differentiation.
- Allows scalable preparation for high-content screening of infection-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant epithelial biology for translational infection and prostate disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of host-pathogen mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting epithelial infection pathways.
- Supports evaluation of candidate interventions in a system reflecting in vivo cellular diversity.
Pipeline & Workflow Integration
This organoid-based 2D model bridges early discovery and preclinical infection research, enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative readouts within a unified workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of infection mechanisms and epithelial responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection and barrier function assays for compound evaluation.
- Analytics: Provides immunofluorescence, TEER, and flow cytometry outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease-relevant cellular organization for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse prostate disease and infection studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection biology.
- Operational Value: Standardizes epithelial infection assays with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of infection and prostate disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, epithelial differentiation, and infection assays.
- Needs access to immunofluorescence microscopy, TEER instrumentation, and flow cytometry.
- Demands cross-team standardization of cell seeding, differentiation, and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial models with protocol optimization for tissue specificity.
- Barrier function and cellular diversity must be validated for each experimental batch.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
