Een eenvoudige microaspiratietechniek om somatische cellen te isoleren uit gecryopreserveerd paardenzaad als nucleaire donoren voor klonen

We willen aantonen dat somatische cellen uit cryoppreserve paardensperma nuttig kunnen zijn om individuen met een hoge genetische waarde terug te krijgen. Onze huidige uitdaging is om somatische cellen met intact diploïde DNA te selecteren om als nucleaire donor te gebruiken. Om te beginnen haal je de paardenzaadrietjes uit de vloeibare stikstoftank.

Blootstel ze 10 seconden aan lucht en ontdooi ze 30 seconden in een waterbad op 37 graden Celsius. Neem een monster van 250 microliter van het ontdooide sperma. Verdun het met één milliliter aangevuld DMEM-F12 medium.

Broed het spermamengsel 30 minuten uit bij 37 graden Celsius. Pipett 25 microliter uit de geïncubeerde verdunning in een buis en verdun dit in 975 microliter DPBS, aangevuld met 0,1 milligram per milliliter polyvinylalcohol of polyvinylpyrrolidon. Meng de ophanging voorzichtig.

Houd het verdunde spermamengsel gedurende het hele celverzamelproces op 37 graden Celsius. Plaats een petrischaaldeksel met verdund paardenzaad op het microscooppodium ter voorbereiding op somatische celverzameling. Selecteer een micropipet met geschikte diameter voor somatische celverzameling en verbind deze met het mechanische aspiratiesysteem.

Steek de micropipet voorzichtig in de microdruppel en lijn deze uit met de basis van het afwasdeksel. Zodra de pipet kweekmedium heeft geaspireerd, begin je met individuele vangst van somatische cellen. Focus op de onderkant van de microdruppel, waar verschillende celmorfologieën zichtbaar zijn.

Plaats de micropipettip naast elke somatische cel en aspireer onder negatieve druk. Verzamel alle ronde en langgerekte cellen, ongeacht de grootte. Na het verzamelen van 10 cellen, plaats je ze in een microdruppel van 10 microliter die zich aan de bovenkant van het deksel van de schotel bevindt.

Houd alle verzamelde somatische cellen in deze microdruppel tijdens het hele verzamelproces. Zodra het gewenste aantal somatische cellen is verzameld, voer je een eenvoudige wasprocedure uit met microdruppels om sperma, vuil en microbiële verontreinigingen te verwijderen. Met een tweede deksel voert u een sequentiële driestapswasbeurt uit van somatische cellen.

Gebruik een micropipet om de somatische cellen in de eerste druppel over te brengen en laat ze drie tot vijf minuten bezinken. Overbreng de cellen van de eerste druppel naar de tweede druppel met dezelfde procedure. Herhaal de overdracht nogmaals en plaats de somatische cellen in de derde druppel.

Tot slot worden de geïsoleerde somatische cellen in een voorbereide microdruppel geplaatst die bestemd is voor somatische celkernoverdracht. De microaspiratietechniek haalde met succes somatische cellen uit cryoppreserve equine sperma, met vangstsnelheden variërend van 317,7 tot 424,7 cellen per uur over drie hengsten. Hengst nummer 3 toont de hoogste opbrengst.

Vijf verschillende somatische celtypen werden geïdentificeerd op basis van grootte en morfologie. We hebben een populatie somatische cellen geïdentificeerd die verschilt in morfologie en levensvatbaarheid in cryoppreserve equine sperma, wat nuttig kan zijn als nucleaire donor. De cellen kunnen worden geselecteerd op basis van hun morfologie, en de procedure vereist geen primaire kweek.

We richten ons op het verbeteren van de levensvatbaarheid van deze cellen na het bulken van paardenzaad.