Peroxisoomkleuring in zoogdiercellen met behulp van peroxisoomspecifieke probes

Ons onderzoek richt zich dus op het begrijpen van peroxisomen, essentiële organellen voor het lipidmetabolisme en de cellulaire oxidatieve balans. We streven ernaar te achterhalen hoe hun structuur en functie worden gereguleerd en hoe deze processen veranderen bij ziekte. Om dit te bereiken ontwikkelen we fluorescerende probes waarmee wij en de bredere wetenschappelijke gemeenschap peroxisomen in een reeks dierlijke cellen kunnen visualiseren.

Hier ontwikkelen we kleuringsprotocollen die werken in zowel levende als vaste cellen, en krachtige hulpmiddelen bieden voor het bestuderen van paroxetinebiologie in gezondheid en pathologie. Een van de belangrijkste experimentele uitdagingen is het bereiken van niet-invasieve labeling van peroxisomen in dierlijke cellen. Hoewel antilichaamkleuring helpt dit te overwinnen, is er een gebrek aan commercieel verkrijgbare antilichamen voor paroxysmale eiwitten.

Een andere uitdaging is het visualiseren van peroxisomen niet-invasief in realtime, wat aanpasbare protocollen vereist. En tot slot levert conventioneel beitsen geen functionele weergave op. Hoewel peroxidase-gebaseerde kleuring kan variëren afhankelijk van de paroxysmale functie, wat zowel een uitdaging als een kans is, omdat het ons in staat stelt paroxysmale functionele toestanden binnen de cel te onderscheiden.

Begin met zoogdiercellen die de dag ervoor zijn ingezaaid in een plaat met dekmantels die nu op een confluentie van 30 tot 70% liggen. Verdun de peroxisoomprobe met vers medium in een lichtgevoelige, microcentrifugeerde buis om een eindconcentratie van vier micromolaren te bereiken. Selecteer de gewenste put om te beitsen en label de buitenkant met een markerpen.

Aspireer 0,5 milliliter medium uit de geselecteerde put en vervang dit door het voorbereide probe-medium druppel voor druppel langs de wand van de put. Na het dispenseren incubeer je de cellen op 37 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Vanaf dat moment bescherm je de cellen tegen licht met aluminiumfolie.

Na de incubatie verwijder je voorzichtig het gekleurde medium en was je de cellen twee keer met PBS. Plaats vervolgens de plaat onder een chemische kap, voeg 4% paraformaldehyde in PBS toe aan de cellen en incubeer 20 minuten op kamertemperatuur. Na fixatie verwijder je de paraformaldehyde in een aangewezen afvalcontainer en was je de cellen één keer met PBS.

Voeg vervolgens 0,5% Triton X toe aan PBS om de cellen te permeabiliseren en incubeer 2,5 minuten. Na de incubatie verwijder je de Triton X en was je de cellen twee keer met PBS gedurende elk 10 minuten. Om de cellen te blokkeren, incubeer je ze met 5% runderserumalbumine in PBS 's nachts bij vier graden Celsius.

Voer de immunofluorescerende kleuringsprocedure uit volgens het standaardprotocol. Voer tenslotte een microscopie uit om beelden te maken van zowel vaste als levende cellen. Levende celkleuring met Peroxi_SPY probes resulteerde in ATP-bindende cassette-subfamilie D-afhankelijke import in peroxisomen, wat resulteerde in een hoge peroxisoom-cytoplasma fluorescentieverhouding in metabolisch actieve cellen.

In wildtype HEK-293T-cellen die GFP-SKL expressief hebben, vertoonde Peroxi_SPY555 kleuring duidelijke colocalisatie met peroxisomen, terwijl bij PEX19-knockoutcellen zonder peroxisomen de kleuring ontbrak. Bij humane fibroblasten was Peroxi_SPY kleuring gecolokaliseerd met de paroxysmale marker GFP-SKL, wat peroxisoomtargeting bevestigde. Kwantificering van peroxisoomdichtheid toonde significante variatie tussen verschillende celtypen.

Geoptimaliseerde kleuringscondities in COS-7-cellen met 250 nanomolaire Peroxi_SPY gedurende 20 minuten verhoogden de peroxisoom-cytoplasma fluorescentieverhouding aanzienlijk vergeleken met het oorspronkelijke protocol van één micromolair voor 10 minuten. Langdurige incubatie van HEK-293T-cellen met Peroxi_SPY gedurende 24 uur leidde tot een verbeterde peroxisoom-cytoplasma fluorescentie-intensiteitsverhouding ten opzichte van 15 minuten, ondanks verminderde peroxisoomkleuring. Een fixatieprotocol maakte succesvolle antilichaamcokleuring mogelijk, aangetoond door geconserveerde Peroxi_SPY-labeling en anti-PEX14 immunokleuring in HuH-7- en HEK-293T-cellen.

Kwantificering toonde aan dat fixatie- en permeabilisatieprocedures de peroxisoom-fluorescentieintensiteit beïnvloedden in vergelijking met levende celkleuring. We hebben de Peroxi_SPY kleurstof ontwikkeld die gebruikt kan worden om peroxisomen te visualiseren in zowel levende als gefixeerde dierlijke cellen. Onze fluorescerende sonde kan een eenvoudige en snelle methode bieden om peroxisoomdynamiek, heterogeniteit en disfunctie te bestuderen op manieren die voorheen beperkt waren.

Dit protocol maakt beeldvormingsgebaseerd peroxisoomonderzoek mogelijk in diverse celtypen, waaronder patiëntafgeleide cellen met paroxysmale aandoeningen.