Modellering van hersenmetastase: gestandaardiseerde analyse van metastatische kolonisatie en histologische groeipatronen door stereotactische intracorticale injectie

Onze groep onderzoekt hoe tumorcellen de hersenen koloniseren en hoe metastatische groeipatronen klinische uitkomsten en behandelingsresponsen beïnvloeden. Om te beginnen weeg je elke muis met een precisieweegschaal om het benodigde volume verdoving te berekenen op basis van het lichaamsgewicht. Na het toedienen van het narcose, plaats je de muis op een voorwarme warmtemat, die op 37 tot 38 graden Celsius wordt gehouden ter ondersteuning van de thermoregulatie, en breng je vervolgens oogzalf aan om het hoornvlies tegen uitdroging te beschermen.

Bereid de muis voor met behulp van een aseptische techniek die is goedgekeurd door de lokale dierenethiekcommissie. Desinfecteer de hoofdhuid grondig met een jodiumoplossing. Controleer de diepte van de anesthesie met een knellen in de teen, rek vervolgens de huid strak en maak een middenlijnincisie van ongeveer drie tot vier millimeter langs de schedel met een steriel scalpel.

Met hetzelfde scalpel schraap je voorzichtig het periost weg om het schedeloppervlak bloot te leggen. Bevestig de kop van de muis in een stereotactisch frame met oorbeulen. Met behulp van de stereotactische arm lokaliseer je de bregma, beweeg je de arm twee millimeter naar voren en één millimeter lateraal naar rechts, en markeer je de doelplaats in de frontale cortex met een chirurgische marker.

Boor voorzichtig door de schedel op de gemarkeerde plek met een precisieboor voor tandheelkundige tanden, zodat de dura mater niet wordt doorboord. Bevestig de opening door de plek voorzichtig te onderzoeken met een steriele tang. Vervolgens wordt de tumorcelsuspensie opnieuw opgeschorst door op en neer te pipetteren om een gelijkmatige verdeling te garanderen.

Laad drie microliter van de ophanging in een 10-microliter Hamilton-spuit en plaats deze in het stereotactische frame met de juiste houder. Plaats de spuitnaald voorzichtig boven het boorgat, waarbij je ervoor zorgt dat de afschuining naar links wijst voor de consistentie van de injectie. Steek de naald verticaal in het hersenweefsel tot een diepte van 3,5 millimeter.

Zodra de vereiste diepte is bereikt, trek je de naald langzaam 0,5 millimeter terug om reflux van de celsuspensie te voorkomen en spuit je drie microliter van de tumorcelsuspensie langzaam gedurende een minuut. Houd de naald na de injectie nog eens twee minuten op zijn plaats zodat de cellen en de extracellulaire matrix kunnen stabiliseren en reflux wordt geminimaliseerd. Haal dan voorzichtig de spuit terug en haal de muis uit het stereotactische frame.

Spoel de schedel voorzichtig met een steriele 0,9% natriumchlorideoplossing en sluit het graafgat af met botwas. Sluit de hoofdhuidincisie met drie tot vier hechtingen, waarbij elke hechting met drie strakke knopen dicht bij de wondrand wordt gelegd voor optimale genezing. Markeer de oren van de muis met een passend oorpunchpatroon dat overeenkomt met het aangewezen identificatienummer.

Breng vervolgens indien nodig opnieuw oogzalf aan om het hoornvlies tijdens het herstel te voorkomen en zet de muis terug op een voorwarme warmtekussen die op 37 tot 38 graden Celsius wordt gehouden om het herstel van de narcose te bevorderen. Maak de Hamilton-spuit grondig schoon en desinfecteer door de naald en het vat drie keer achter elkaar uit te spoelen, eerst met gedestilleerd water, daarna met 70% ethanol en tenslotte met steriele 0,9% natriumchlorideoplossing. Na het spoelen bewaar de Hamilton-spuit op ijs tot het volgende gebruik.

Geef tenslotte een pijnstillend middel subcutaan terwijl de muis nog onder narcose is om directe pijnverlichting na de operatie te garanderen. Huismuizen individueel tijdens het herstel voor een korte periode, niet langer dan een uur, om verwondingen door interacties tussen wakkere en herstellende dieren te voorkomen. Als er tekenen van stress of abnormaal gedrag worden waargenomen tijdens de monitoringperiode, beoordeel dan de neurologische functie met behulp van de hangdraadtest om de gripsterkte en coördinatie te beoordelen.

Hang een muis op een horizontale draad en registreer of hij binnen 60 seconden een ontsnappingsplatform bereikt. Een niet-gezonde muis bereikt het platform niet en valt van de draad. Na het inleven en verzamelen van dierweefsels wordt het histologische groeipatroon van de metastase en bijbehorende kenmerken geëvalueerd op digitale weefseldia's.

Macroscopische beelden bevestigden de afwezigheid van tumorgroei bij ECM-geïnjecteerde controleklep C-muizen, terwijl zichtbare metastatische laesies aanwezig waren bij muizen die werden geïnjecteerd met tumorcel ECM-suspensies. Muizen die werden geïnjecteerd met 4T1- of 410,4-borstkankercellen vertoonden een significant hogere metastatische belasting vergeleken met ECM-geïnjecteerde controlegroepen, zonder significant verschil tussen de twee tumorcellijnen. De overlevingsanalyse van Kaplan Meyer toonde aan dat muizen die met 410,4 tumorcellen werden geïnjecteerd, een significant langere algehele overleving hadden vergeleken met die met 4T1-cellen.

Histologische analyse toonde aan dat 4T1- en 410.4-hersenmetastasen verschillende groeipatronen vertoonden, waarbij 4T1 cohort-achtig was en 410.4 een strengachtige epitheliale infiltratieve groei. Onjuiste stereotactische injectie leidde tot tumorgroei in de schedel en hersenvlies door celsuspensielekkage, terwijl correcte intracorticale injectie resulteerde in parenchymale metastasen met daaropvolgende meningeale verspreiding. We hebben aangetoond dat groeipatronen van hersenmetastasen de prognose en neurologische dood beïnvloeden, wat de relevantie ondersteunt voor het sturen van klinische besluitvorming.

Dit protocol is vooral nuttig voor het bestuderen van metastatische kolonisatie in late toestanden, waarbij klinisch relevante aspecten zoals groeidynamiek en secundaire verspreiding worden behandeld. In tegenstelling tot andere methoden zorgt het stereotactische model voor hersenspecifieke kolonisatie en behoudt het volledige systeemcomplexiteit, waardoor langdurige studies van tumorprogressie en therapierespons mogelijk worden. Door een reproduceerbaar klinisch relevant platform te bieden, draagt ons model bij aan het begrijpen van de mechanismen van hersenkolonisatie en het verkennen van nieuwe therapeutische strategieën.