Bepaling van microbiële biomassa in de bodem met behulp van Digital Droplet PCR (ddPCR)

Onze studie gebruikt druppels digitale PCR en whole genome sequencing om microbiële biomassa nauwkeurig te kwantificeren over verschillende bodemtypen. Conventionele methoden vereisen grote bodemmonsters en schadelijke chemicaliën. ddPCR gebruikt minimale bodem voor absolute kwantificatie van genen en biomassa koolstof.

Om te beginnen verzamel je de reagentia van de bodem-DNA-extractiekit om het DNA te isoleren van bodemmicroben bij 20 graden Celsius kamertemperatuur. Draai de twee milliliter kraalknipbuis kort en controleer of de kralen onderaan zijn neergezet. Voeg 100 milligram aarde toe, daarna 800 microliter Solution CD1 en vortex kort om te mengen.

Gebruik een bead mill homogenizer met een snelheid van zes meter per seconde gedurende 40 seconden om het monster grondig te lyseren en centrifugeer de bead-beating tube op 15.000 g gedurende één minuut bij kamertemperatuur om mechanische cellyse te bereiken. Breng het supernatant dat mogelijk nog bodemdeeltjes bevat over in een schone microcentrifugebuis van twee milliliter. Voeg 200 microliter Solution CD2 toe.

Vortex vijf seconden en centrifugeren op 15.000 g gedurende één minuut. Breng tot 700 microliter supernatant over in een schone microcentrifugebuis van twee milliliter zonder de pellet te verstoren. Voeg 600 microliter Solution CD3 toe aan het supernatant en vortex gedurende vijf seconden.

Laad 650 microliter van het mengsel op een spinkolom en centrifugeer op 15.000 g gedurende één minuut. Verwijder de doorstroming en herhaal het proces voor het resterende lysaat. Plaats vervolgens de spinkolom in een schoon opvangbuisje van twee milliliter.

Voeg 500 microliter Solution EA toe aan de spinkolom en centrifugeer op 15.000 g gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroming weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis. Voeg 500 microliter Oplossing C5 toe aan de spinkolom en centrifuge zoals eerder aangetoond te worden.

Na het weggooien van de doorstroming plaats je de spinkolom in een nieuwe opvangbuis van twee milliliter en centrifugeer je op 16.000 g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Plaats de spinkolom in een nieuwe 1,5 milliliter eluatiebuis. Voeg 50 tot 100 microliter van de oplossing C6 toe aan het midden van het filtermembraan van de spinkolom.

Centrifugeer op 15.000 g gedurende één minuut. Bewaar de buis met het eluent op vier graden Celsius nadat je de spinkolom hebt weggegooid. Kwantificeer geëxtraheerd DNA met een fluorometer en een dubbelstrengs DNA-breedbereik assaykit volgens de instructies van de fabrikant.

Voor de analyse van bacteriën en schimmels, selecteer specifieke 16S rRNA- en 18S rRNA-primers. Na het ontdooien, vortex alle reagentia op ijs. Stel de Digital Droplet Polymerase Chain Reaction, of ddPCR, op.

Plaats de druppelgeneratorcartridge, of DG8, in de cartridgehouder. Voeg in totaal 20 microliter van het reactiemengsel toe aan elk van de monsterputten in de cartridge. Voeg vervolgens 70 microliter Droplet Generation Oil voor Evagreen toe aan de cartridge met een goed gelabelde olie.

Plaats de cartridge in de druppelgenerator en bedek deze met een pakking. Breng 40 microliter van de gegenereerde druppels over naar elke put van een 96-put half-skirt plaat voor PCR-versterking. Sluit de plaat af met een plaatsealer die vijf seconden vooraf is ingesteld op 180 graden Celsius.

Stel het thermische cyclusprofiel in en stel het verwarmde deksel in op 105 graden Celsius. Na voltooiing van PCR wordt de 96-wellplaat overgebracht naar de plaatlezer. Met QuantaSoft versie 2.1 kun je de drempel van de amplitude aanpassen om negatieve en positieve druppels te scheiden.

Vanuit elke put worden de parameters geëvalueerd, zoals het aantal genkopieën per nanogram DNA, het totale aantal genkopieën per nanogram geëxtraheerd DNA, genkopieën per gram drooggewicht van de bij de extractie verwerkte bodem, en het aantal cellen per gram drooggewicht van de bodem. Bereken verder de Microbial Biomass Carbon, of MBC, die overeenkomt met bacteriën en schimmels per gram drooggewicht van de bodem per put. Driedubbele analyse van bodem-DNA van vijf locaties leverde gemiddelde concentraties microbieel DNA op variërend van 32 nanogram tot 4.590 nanogram per gram droge grond per monster.

Bodem B bevatte de minste 16S rRNA-genkopieën gemiddeld 8,8 keer 10 in de macht van zeven, en rRNA-genkopieën met gemiddeld 4,6 keer 10 per gram droge grond. Ter vergelijking: Soil E had de hoogste tellingen van 16S en 18S rRNA-genkopieën met een gemiddelde van 4,4 keer 10 in de macht van negen en 2,5 keer 10 tot de macht van negen per gram droge bodem, wat aanzienlijk verschilde van alle andere monsters. Hoewel schimmelkopieën vergelijkbaar bleven over bodems A, B, C en D, verschilden de bacteriële aantallen in bodem D significant van zowel B als E. De hoogste microbiële inhoud werd waargenomen in bodem E, terwijl de laagste microbiële inhoud werd gevonden in monsters verzameld uit bodem B die significant verschilden tussen A, D en E. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de dynamiek en structuur van bodemgemeenschappen te meten via microbiële biomassa en de schimmel-bacterieverhouding.

Hetzelfde sjabloon-DNA dat wordt gebruikt voor druppeldigitale PCR kan worden gebruikt voor DNA-sequencing om microbiële gemeenschaps- en functionele analyse mogelijk te maken.