Fluorescentie-gebaseerde calciumbeeldvorming in primaire epitelkweken van de menselijke luchtweg met behulp van geautomatiseerde celsegmentatie

Single-cel transcriptomics tonen heterogeniteit aan in het cystische fibrose luchtwegepitheel. We zijn van plan te begrijpen hoe celtype-specifieke functies en veranderingen de ziektepathogenese beïnvloeden. De huidige uitdaging is om de proteomica en functies van enkelcellige cellen nauwkeurig te meten.

Dit vereist nog steeds technische ontwikkeling. Om te beginnen houd je Calu-3-cellen in T-25-flesjes met Eagle's Minimum Essential Medium Culture Media, aangevuld met 20% FBS en 1% penicillinestreptomycine. Wanneer de cellen ongeveer 70% samenvloeiing bereiken, spoel je ze met vijf milliliter PBS.

Na het wassen voeg je één milliliter TrypLE direct toe aan de cellen en plaats je de fles in een broedmachine ingesteld op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 10 tot 15 minuten. Neutraliseer vervolgens de TrypLE door vier milliliter verse complete cultuurmedia toe te voegen en de celsuspensie grondig te mengen. Plat de cellen in een 96-wellplaat met ongeveer 90% tot 100% confluenz, wat overeenkomt met ongeveer 40.000 cellen per put.

Laat de cellen een nacht aan de 96-wellplaat hechten. Vervang het medium elke dag en blijf de cellen twee tot vijf dagen na confluentie cultiveren om differentiatie mogelijk te maken. Op de proefdag was je de Calu-3 cellen en broed je ze uit met geschikte kleurstoffen.

Voeg vervolgens 100 microliter per put toe van 2,5 millimolaire probenecide verdund in calciumbuffer om de kleurstof in de cytoplasmatische ruimte te behouden en wikkel de plaat in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen tot de beeldvorming. Voor primaire luchtwegcellen. Verwijder het basolaterale medium uit de transwell en was de apicale zijde door 300 microliter calciumbuffer toe te voegen.

Was vervolgens de basolaterale zijde door 750 microliter calciumbuffer toe te voegen. Verwijder de buffer door te pipetteren en herhaal de wash aan beide zijden. Vervolgens incubeer je de cellen met 200 microliter kleurstofoplossing aan de apicale kant en 600 microliter aan de basolaterale zijde gedurende een uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Tijdens de incubatie bereid je thapsigargine verdund in calciumbuffer als een drie keer zo grote tussenvoorraad. Pas de concentratie aan naar zes micromolair om een uiteindelijke concentratie van twee micromolaren in de put te bereiken. Na de incubatie verwijder je de kleurstofoplossing uit zowel het apicale als het basolaterale compartiment door te pipetteren.

Was de cellen twee keer met 300 microliter calciumbuffer aan de apicale kant en 750 microliter calciumbuffer aan de basolaterale zijde. Verwijder daarna de buffer door te pipetteren. Voeg vervolgens 100 microliter 2,5 millimolaire probenecide in calciumbuffer toe aan het apicale compartiment en 500 microliter van dezelfde oplossing aan het basolaterale compartiment.

Houd de transwell-insert binnen de plaat, wikkel de hele plaat in aluminiumfolie om hem tegen licht te beschermen en leg de omwikkelde plaat apart voor beeldvorming. Open de Fiji-applicatie. Selecteer Bestand en selecteer Open om het videobestand te uploaden.

In het resulterende pop-upvenster bewaar je alle standaardinstellingen en bevestig je de selectie. Pas indien gewenst het beeldscherm aan door Afbeelding te selecteren, Aanpassen te kiezen en op Helderheidscontrast te klikken. Pas de helderheid en het contrast van individuele fluorescentiekanalen aan om een optimaal beeld van de cellen te bereiken.

Om celtracering te vergemakkelijken, voeg kanalen samen door Afbeelding te selecteren, Kleur te kiezen en op Kanalen samenvoegen te klikken. Wijs in het pop-upvenster de juiste bestanden toe aan elk individueel kanaal en bevestig de selectie. Voor tracing selecteer je Analyze, Kies Tools en open ROI Manager.

In het resulterende pop-upvenster schakelt u zowel de opties Toon Allen als Labels in. Met behulp van het vrijhandse selectietool traceert u zorgvuldig individuele cellen op basis van celgrenzen en de nucleaire kleuring. Druk vervolgens op de T-toets om elke getraceerde cel aan de ROI-lijst toe te voegen.

Zorg ervoor dat cellen in alle vier de hoeken van het gezichtsveld en in het midden van de video worden getraceerd. Zodra alle cellen nauwkeurig zijn getraceerd, klik je in het ROI Manager-venster op Meer en selecteer Multi Measure. In het resulterende pop-upvenster drukt u op OK om de meting te starten.

Open het videobestand in Fiji. Optimaliseer de nucleaire en groene fluorescentiekanalen voor het bekijken met behulp van de beeldaanpassingstools. Zodra de kanalen geoptimaliseerd zijn, dupliceer je één frame door Afbeelding te selecteren en Dupliceren te kiezen.

In het resulterende pop-upvenster selecteert u Duplicate stack uit en slaat u de gedupliceerde afbeelding op als een PNG-afbeeldingsbestand. Herhaal de frameduplicatie voor het andere kanaal door Afbeelding te selecteren en Dupliceren te kiezen. In het pop-upvenster drukt u op OK en slaat u de afbeelding op als PNG-bestand.

Voeg de twee opgeslagen afbeeldingen samen door Afbeelding te selecteren, Kleur te kiezen en op Kanalen samenvoegen te klikken. Wijs vervolgens elk PNG-bestand toe aan het juiste kanaal en bevestig de samenvoeging. Upload de samengevoegde afbeelding in de cel-postgrafische gebruikersinterface om een celmasker te genereren.

Segmenteer het beeld met de nucleaire kleuring als kanaal één en de cytoplasmatische kleuring is kanaal twee door het cyto3-model te selecteren. Sla nu de gegenereerde maskerafbeelding op als een PNG-bestand. Open het in Fiji en zet het om naar een TIFF-bestand.

Open tenslotte zowel het maskerbestand als het originele videobestand in de calciumsuite door ze te slepen en neerzetten in de software-interface. Klik op Gegevens analyseren om een downloadbare grafiek en een downloadbaar CSV-bestand te genereren met genormaliseerde en ruwe intensiteitswaarden voor alle geanalyseerde cellen. De fluorescentieintensiteit genormaliseerd naar de basislijn nam in de loop van de tijd toe in individuele Calu-3-cellen na thapsigargine-stimulatie wanneer gemeten met zowel Fluo-4 AM als Cal-520 AM; de maximale calciumafhankelijke fluorescentieactivatie na thapsigargine was significant hoger in Calu-3-cellen gemeten met Cal-520 AM vergeleken met Fluo-4 AM. Evenzo vertoonden individuele primaire luchtweg- en bronchiale cellen een verhoogde genormaliseerde fluorescentie na thapsigargine-stimulatie met een van de kleurstoffen.

Daarnaast was de maximale calciumafhankelijke fluorescentieactivatie significant hoger in cellen geladen met Cal-520 AM. Machine learning-gebaseerde analyse identificeerde en kwantificeerde calciumafhankelijke fluorescentieveranderingen in 1.441 individuele cellen, vanuit één gezichtsveld. Genormaliseerde fluorescentiesporen die door de software werden gegenereerd, toonden calciumresponsen voor alle 1.441 geïdentificeerde cellen na thapsigargine-stimulatie. Onze studies zullen helpen bij het begrijpen van de reacties van verschillende celtypen op hun omgeving, wat zal bijdragen aan de ontwikkeling van gerichte therapieën.

Onze bevindingen hebben het potentieel om zich te richten op verschillende celtypen, om bepaalde levende celresponsen toe te wijzen aan omgevingsprikkels. In de toekomst zijn we van plan te onderzoeken hoe celtype-specifieke signalering in ziekte- en gezonde cellen wordt veranderd om de typen te bepalen die verantwoordelijk zijn.