Reproduceerbare opstelling voor in vivo tweefotonbeeldvorming van de contractiliteit van cervicale lymfatische vaten en lymfestroom bij muizen

We presenteren de noodzaak voor een nieuwe beeldvorming van de contractiliteit van cervicale lymfavaten en lymfatische verwijdering van rode bloedcellen bij muizen. Het bestuderen van de functies van cervicale lymfevaten is uitdagend, vooral wanneer langdurige observatie van de contractiliteit van de lymfestroom en de tracercirculatie vereist is. Om te beginnen plaats je een stalen optische rail van 270 millimeter lang en 43 millimeter breed als basis van het apparaat.

Plaats twee paalhouders bovenop de stalen optische rail, zodat er een afstand van 175 millimeter tussen hen is. Steek twee bevestigingspalen met een diameter van 12 millimeter in de paalhouders en zet elk vast met een M6-schroef. Bevestig vervolgens een paalkraag aan elk van de twee bevestigingspalen.

Bevestig een haakse vaste postklem aan een van de bevestigingspalen en bevestig deze stevig met een M6-schroef. Steek een 12-millimeter bevestigingspaal in het zijgat van de haakse balkklem. Bevestig een 3D-geprinte houder aan de ingevoegde zijbevestigingspost en bevestig deze stevig met twee paar M3-schroeven.

Met UV-uithardbare lijm bevestig je een afdekglas van 12 millimeter aan de onderkant van een beschermende 3D-geprinte behuizing. Bevestig vervolgens de beschermbehuizing aan de 3D-geprinte houder met een M4-schroef/moer-paar. Installeer een precisie-pantograaftafel voor verticale beweging op de stalen optische railbasis met behulp van twee tafelclips en sets M6-schroeven, moeren en ringen.

Leg vervolgens een 3D-geprinte hoes van 155 millimeter lang en 110 millimeter breed op het tafelblad. Deze behuizing dient als reservoir voor het ophopen van zoute oplossing. Bedek het aansluitpunt van de draden op verwarmingselement één met een dunne laag siliconen.

Bevestig temperatuursensor één aan de mat en sluit die af met siliconen. Soldeer de draden van het verwarmingselement en temperatuursensoren aan een meerdraadkabel. Vul het aansluitpunt met siliconen en sluit het met krimpfolie.

Plaats verwarmingselement twee en temperatuursensor twee in de foamroller. Bevestig de connectoren voor de stroomkabel en de aan/uit-knop aan de wanden van de behuizing van de besturingsunit. Installeer een 24-volt gelijkstroomvoeding, een gelijkstroom-step-down omvormer en twee MOSFET-modules in de behuizing.

Na het assembleren van het circuit en het solderen van de benodigde componenten, bevestig je de Arduino Uno en het toetsenbordscherm in de dekselbehuizing. Zoek het temperatuurselectieveld. Stel de temperatuur in en druk op 'run'.

Na het verdoofen van de muis breng je oogzalf aan op beide oogleden om te voorkomen dat de oogbollen tijdens de operatie uitdrogen. Zodra de terugtrekkingsreflex van de achterpoot en het intrekken van de staart stoppen, plaats je de muis op zijn rug op het verwarmingselement om toegang te krijgen tot het buikgebied. Sluit de besturingsunit aan op een stopcontact met een ingangsspanning van 175 tot 240 volt wisselstroom.

Met medisch tape bevestig je het lichaam van het dier in een positie parallel aan het tafeloppervlak en plaats je de kop schuin ten opzichte van de sagittale as zodat één kant van de nek op de rol rust. Wikkel een ligatuur om de bovenste snijtanden en bevestig deze aan de achterkant van het apparaat en gebruik medisch tape om de lichaamstemperatuur van het dier op peil te houden. Vervolgens scheer je de vacht vanaf de nekstreek.

Verwijder vervolgens eventuele resterende losse haren en bedek het dier om het steriele veld te behouden. Voor de eerste desinfectie desinfecteer je de huid van de nek met een alcoholstaafje. Breng vervolgens een 0,5% chloorhexidineoplossing of een 2% jodiumoplossing aan voor antiseptische behandeling en herhaal het desinfectieproces nog twee keer.

Na het bevestigen van de verdovingsdiepte met een teenknijpreflex, voer je een dermatotomie uit door een longitudinale incisie te maken langs de nekhuid van de onderkaak tot het sleutelbeen, ongeveer twee centimeter lang. Voer vervolgens een fasciotomie uit met een microchirurgische gebogen schaar. Met een gebogen pincet duw je voorzichtig de speekselklieren en oppervlakkige nekspieren opzij om de sternocleidomastoïdeus bloot te leggen.

Zorg ervoor dat zichtbare bloedvaten niet beschadigd raken en bevochtig het operatieveld continu met zoutoplossing om weefselschade te voorkomen. Gebruik een microchirurgische schaar om een myotomie van de sternocleidomastoïdeus uit te voeren, waardoor toegang wordt tot het gebied tussen de luchtpijp en de halsslagader. Blijf de spieren en fascia spreiden en voer zowel myotomie als fasciotomie uit.

Vervolgens lokaliseer je de diepe cervicale lymfeklier samen met de afferente en efferente lymfevaten op een diepte van vijf tot zeven millimeter. Plaats het apparaat met het vaste dier op de verplaatsbare microscooptafel. En bevestig het apparaat op zijn plaats door het stevig vast te maken met een M6-schroef om stabiliteit tijdens de beeldvorming te garanderen.

Bevestig de katheter, vooraf gevuld met zoutoplossing, met medisch tape aan de bevestigingspaal. Plaats een roller met een diameter van één centimeter onder het verwarmingselement aan de zijkant van het hoofd van het dier om een helling van 45 graden ten opzichte van de microscooptafel te behouden. Plaats vervolgens de vaste katheter in het chirurgisch geopende nekgebied zodat deze dicht bij het sleutelbeen van het dier ligt en zet de zoutoplossing aan om de open halsholte te vullen met zoutoplossing.

Laat de beschermende behuizing zakken over het met zoutoplossing gevuld nekgebied zodat het lymfevat in het midden van het kijkveld ligt. Plaats vervolgens de beschermende behuizing op de luchtpijp zonder druk uit te oefenen. Laat ten slotte de niet-water-onderdompeling twee-fotonenlens in de beschermende behuizing zakken tot de juiste diepte op basis van de werkafstand van de lens en voer een visualisatie van twee fotonen uit van het cervicale lymfevat.

Na de procedure werd succesvolle identificatie van de diepe cervicale lymfeklieren bevestigd door Evans Blue-accumulatie in het weefsel. Tweefotonmonitoring van de contractiliteit van het cervicale lymfatische vat werd uitgevoerd vóór en na fotobiomodulatie. Fotobiomodulatie verhoogde de contractiliteit van de cervicale lymfevaten aanzienlijk bij muizen van 2 en 18 maanden met vergelijkbare intensiteit.

Kwantitatieve analyse toonde aan dat de contractiliteit van cervicale lymfevaten significant lager was bij muizen van 24 maanden vergeleken met muizen van 2 en 18 maanden. De waarden verschilden echter niet significant tussen muizen van 2 en 18 maanden. Fotobiomodulatie verhoogde de contractiliteit van de cervicale lymfaat vaten significant bij muizen van 2 en 18 maanden, maar had geen effect bij muizen van 24 maanden.

Rode bloedcellen die in de rechter laterale ventrikel werden geïnjecteerd, werden vier uur na injectie waargenomen in de cervicale lymfevaten en bleven na vijf uur door het lumen bewegen, waarmee de richting van de hersenen naar de periferie werd bevestigd. Ons protocol faciliteert in vivo monitoring van de functie van het cervicale lymfevat, terwijl de contractiliteit tot vijf uur observatie behouden blijft. Onze methode biedt goede reproduceerbaarheid en is compatibel met verschillende twee-foton microscopen en objectieflenzen, terwijl we een beeld van hoge kwaliteit behouden met dieptes tot 500 micrometer.

Deze techniek kan mogelijk een universeel hulpmiddel worden om de fysiologie van het hersendrainagesysteem en de functies van cervicale lymfevaten te bestuderen.