Multimodale benadering om botregeneratie en steigerprestaties te beoordelen

Ons onderzoek evalueert hoe verschillende biomaterialen de botarchitectuur tijdens het regeneratieproces beïnvloeden. Botregeneratie vereist een multiscale evaluatie, omdat het een hiërarchisch georganiseerde structuur van het weefsel is. Dit protocol maakt analyse van het monster op verschillende schalen mogelijk.

Om te beginnen bevestig je het met hars beliggende tibia met het geïmplanteerde biomateriaal aan de monsterhouder en bevestig je deze aan de instrumentarm. Oriënteer het monster volgens de gewenste doorsneerichting. Verkrijg een diamanten zaagschijf met lage snelheid om het bot in ongeveer 0,7 millimeter sneden te snijden.

Vul het vloeistofreservoir totdat het vloeistofniveau de onderkant van het blad volledig bedekt. Zorg ervoor dat het monster stabiel en horizontaal uitgelijnd is met het schijfoppervlak. Pas de positie van het monster aan met de positioneringsknoppen totdat het snijgebied van het doel uitgelijnd is met het lemmet.

Begin het monster te snijden met een hogere snelheid en oefen lage druk uit totdat er een inkeping ontstaat. Verlaag vervolgens de snelheid om het doorsnijden soepel te voltooien en trillingen te minimaliseren. Stop de zaag direct nadat de zaag is voltooid.

Vervolgens wordt het gesneden monster onderzocht met een stereomicroscoop voor de montage. Voor de montage gebruik je een zelfgemaakte constructie bestaande uit een binnenste massieve roestvrijstalen cilinder en een holle buitenste cilinder die mechanische ondersteuning biedt tijdens het polijsten. Plaats vervolgens de binnenste cilinder op een hete plaat en verhit deze tot ongeveer 120 tot 140 graden Celsius.

Kies een geschikte was en breng een kleine hoeveelheid was aan op het oppervlak van de verwarmde cilinder, zodat deze volledig smelt. Plaats vervolgens het monster met het oppervlak van interesse naar beneden op het met was bedekte gebied en pers het monster voorzichtig om volledig contact met de gesmolten was te garanderen. Verwijder vervolgens de aluminium cilinder van de hete plaat en laat de was bij kamertemperatuur stollen.

Voor grove en middelmatige polijsten kies je schuurpapier met korrelgroottes van 1, 200, 2, 500 en 4.100 om de monsterdikte te verminderen tot ongeveer 0,15 millimeter. Begin met 1 schuurpapier van korrel 200, gevolgd door 2 korrel van korrel 500 terwijl je licht drukt. Monitor periodiek de dikte van het monster tijdens het polijsten met reflectiemicroscopie.

Zodra de streefdikte is bereikt, polijst je beide zijden van het monster met 4 schuurpapier van korrel 100. Maak het monster continu schoon met gedestilleerd water bij elke polijststap. Voor het laatste polijsten kies je een diamantpasta met deeltjesgrootte van zes of drie micrometer, gebaseerd op de oppervlakteruwheid van het monster.

Breng een kleine hoeveelheid diamantpasta aan op een vilt poetsdoek, gemonteerd op een polijstschijf, en polijst het monster. Om het monster van de cilinder los te maken, verwarm je de was op een hete plaat. Na het verwijderen van het apparaat van de verwarmingsplaat haal je het monster uit de cilinder.

Polijst vervolgens voorzichtig beide zijden van het monster met minimale druk en droogt het gepolijste oppervlak met filterpapier. Voor de microscopie-analyse monteer je het monster tussen een glazen glaasje en de deklaag met dompelolie als montagemedium. Onderzoek de oriëntatie van collageenvezels met behulp van gepolariseerd licht, te beginnen met een lage vergroting tussen 5x en 10x.

Bereid het monster tenslotte voor voor scanning-elektronenmicroscopie om de bot-biomateriaalinterface verder te analyseren. Na polijsten en initiële optische microscopie-analyse maakten intrinsieke monsterkenmerken het mogelijk om het gebied dat onder lichtmicroscopie was geïdentificeerd te koppelen aan de overeenkomstige locatie in de micro-computertomografiedataset. Gepolariseerde lichtmicroscopie onderscheidde reeds bestaand bot, getoond in blauw, van nieuw gevormd bot tijdens genezing, afgebeeld in oranje.

Een hogere vergroting polarisatie-lichtmicroscopie onthulde een grensvlak waar bot groeide in nauwe tegenstelling tot het bestaande corticaal bot met Type I collageenvezels die loodrecht in een dun gebied waren georiënteerd. Scanning elektronenmicroscopiebeeldvorming maakte precieze lokalisatie van interessegebieden mogelijk. Een volume van het geselecteerde gebied werd verder onderzocht met behulp van slice-and-view-tomografie.

De voorkant van de greppel toonde botmorfologie op een groeiende trabecula. Transmissie-elektronenmicroscopie maakt nanoschaalonderzoek van de bot-biomateriaalinterface mogelijk, die gecombineerd kan worden met elektrondiffractie van geselecteerde gebieden. Geselecteerde elektronendiffractiepatronen in het gebied gaven aan dat zowel het biomateriaalgebied als het botgebied uit hydroxyapatietkristallen bestonden.

Energiedispersieve röntgenspectroscopiemapping van het afgebeelde interfacegebied toonde fosfor en calcium. Deze multimodale workflow biedt complementaire inzichten die niet met één enkele beeldvormingstechniek kunnen worden bereikt. Deze workflow vereist aanzienlijke tijd, technische expertise en toegang tot gespecialiseerde instrumentatie.

Het kan functionele correlaties, langdurige botremodellering en biomateriaalontwerp onderzoeken.