Name: Superresolutiebeeldvorming van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Leer diepe, single-molecule localisatiemicroscopie van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing. Deze methode biedt superresolutie zonder aangepaste optica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. 236, Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore-DNA+labels+for+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td><td>Merck&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>3,4-Dihydroxybenzoic acid&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60&times; Apo NA 1.49 objectieflens</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA spin desalting kolom met size-exclusion hars&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>89882</td><td>Zeba Spin Desalting Columns voor stap 2.4</td></tr><tr><td>Accutase - Enzym voor celdetachment</td><td>Promo Cell</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP gekoppeld met aangepast DNA (sdAB-5&rsquo;-TCCTCCTCCTCCT-3&rsquo;)</td><td>Massive Photonics</td><td>Custom product</td><td>Anti-GFP nanobody voor Drosophila</td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP gekoppeld met DNA</td><td>Massive Photonics</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3</td><td>Anti-GFP nanobody voor NUP</td></tr><tr><td>Anti-alpha tubulin (YL1/2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG</td><td>Massive Photonics</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, Secondary sdAB F2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR&zeta; (6B10.2)</td><td>BioLegend</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td>Merck&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Conische centrifugeerbuis 15 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>Conische centrifugeerbuis 50 mL</td><td>VWR International</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>Nikon</td><td></td><td>SDC-OPR microscoop</td></tr><tr><td>Desalting spin kolommen met Sephadex G-25 (size-exclusion hars voor DNA-zuivering)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11743309</td><td>Merk: Cytiva. G-25 kolommen voor stap 2.5</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrous</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;(Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Marck</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Serva</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>Maleimide-PEG2-succinimidyl&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A media</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)</td><td>Merck</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes 0.5 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microvolume UV-Vis Spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticles 90 nm -Goud</td><td>Cytodiagnostics</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Orca Fusion-BT cmos camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (1x oplossing)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol vrij</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Kaliumchloride&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>&nbsp;P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protocatechuat 3,4-Dioxygenase &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>TOM20 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>VWR International</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp;X-100&nbsp;&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltratie centrifugeer filter unit, 100 kDa MWCO</td><td>Merck&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>Fabrikant: Amicon Ultra</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Well Hoog Glasbodem</td><td>Ibidi</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-Slide VI 0.5 Glasbodem</td><td>Ibidi</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

superresolutiebeeldvorming van hele cellen via dna-paint op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

Om de superresolutie-beeldvormingsmogelijkheden van het SDC-OPR-systeem (Figuur 1A) te demonstreren, werd de in-plane resolutie beoordeeld door DNA-PAINT beeldvormingsexperimenten uit te voeren (Figuur 1B) op nucleaire poriecomplexen (NPC's), die een biologische referentiestructuur17 vormen. Figuur 1C toont een representatief DNA-PAINT SDC-OPR-beeld van nucleoporine 96 (Nup96), gelabeld met monomerisch versterkt groen fluorescerende eiwit (mEGFP's) en gelabeld met DNA-geconjugeerde anti-GFP-nanolichamen, in U2OS-cellen. De ingezoomde panelen tonen de NUP-substructuur, en Figuur 1D toont gepaarde Nup96-eiwitten (aangegeven door pijlen) die consistent zijn met de verwachte 8-voudige symmetrie van kernporiën. In Figuur 1E werd de Euclidische afstand tussen Nup96-paren gemeten door ze uit te lijnen en het dwarsdoorsnedehistogram van het opgetelde beeld (n = 16 paren) uit te zetten. De analyse toonde een piek-tot-piek scheiding van (13 ± 2) nm (Figuur 1E), in overeenstemming met resultaten van EM-modellen evenals HILO- en TIR-beeldvorming23. Elke piekpassing toonde een standaarddeviatie van 4 nm, waarmee de hoge lokalisatieprecisie (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) werd bereikt met DNA-PAINT op SDC-OPR, werd bevestigd. Opmerkelijk is dat deze precisie werd gehandhaafd over het gehele 53 × 53 μm² gezichtsveld, wat uitzonderlijk is voor confocale systemen.
Om de mogelijkheid tot multicolor imaging aan te tonen, werden Nup96, mitochondriën en microtubuli in U2OS-cellen DNA-gelabeld voor acquisitie met Exchange-PAINT18. Deze techniek maakt gebruik van orthogonale DNA-beeldvormers die geconjugeerd zijn tot één enkele fluorofoor, waardoor alle doelen met dezelfde laserbron kunnen worden geëxciteerd (Figuur 2A). In plaats van signalen gelijktijdig te verkrijgen, scheidt het deze over sequentiële beeldvormingsrondes, waardoor eenvoudige integratie in elk commercieel SDC-OPR-systeem mogelijk is. Figuur 2B toont Nup96 in blauw met een anti-GFP nanolichaam, mitochondriën in rood met een secundair anti-TOM20 antilichaam, en microtubuli in groen met een primair anti-α-tubuline antilichaam. Opmerkelijk is dat de uitstekende localisatieprecisie voor enkelkleurige Nup96-beeldvorming in alle doelen in het multi-doelwitexperiment behouden bleef, wat resulteerde in lokalisatieprecisie van 3,9 nm voor de NPC, 4,0 nm voor α-tubuline en 3,3 nm voor mitochondriën (Figuur 2B, panelen 1, 2 en 3).
Voor beeldvorming met grote FOV werden microtubuli in HeLa-cellen gefotografeerd met verschillende vergrotingen die beschikbaar zijn op het SDC-OPR-systeem, gecombineerd met verschillende camerabinning-instellingen om pixelgroottes tussen 78 nm en 108 nm te behouden (Figuur 3). Figuur 3A toont het microtubuli-cytoskelet van 10 HeLa-cellen, met kleuren die de lokalisatieprecisie aangeven. Bij 1× vergroting is de gemiddelde lokalisatieprecisie merkbaar slechter vergeleken met hogere vergrotingen (Figuur 3B-D), met een grotere variabiliteit. Dit komt door de verminderde laservermogensdichtheid over het grotere FOV, waar het Gaussische belichtingsprofiel duidelijk wordt, wat leidt tot een verminderde precisie richting de randen van het FOV. Desalniettemin is het bereiken van een gemiddelde lokalisatieprecisie van 9,5 nm over het uitgestrekte 211 × 211 μm² FOV indrukwekkend voor confocaal-gebaseerde systemen en maakt het hoogresolutieonderzoek van biologische heterogeniteit mogelijk.
Ten slotte wordt de mogelijkheid aangetoond om hele cellen in beeld te brengen door DNA-PAINT-beelden van het microtubuli-netwerk te verkrijgen in vaste HeLa-cellen met een confocale volume van ~500 nm dikte en 1 μm z-stap met de hoogste vergroting van het systeem (4×, 53 × 53 μm² FOV). Figuur 4A toont de reconstructiebeelden van één molecuul voor elk z-vlak, samen met de bijbehorende lokalisatieprecisie en NeNA-waarden. Daarnaast wordt een 3D-kleurgerenderde visualisatie van het microtubuli-netwerk in de HeLa-cel weergegeven in Figuur 4C. Naarmate de diepte toeneemt, neemt het aantal gedetecteerde fotonen af door verstrooiing en optische aberraties, wat resulteert in een verminderde lokalisatieprecisie voor zowel de lokalisatieprecisie afgeleid van de Cramér-Rao Lower Bound (CRLB) (Figuur 4A, rechts) als die berekend met de NeNA-metriek. Toch maakt het hoge niveau van fotonenverzameling mogelijk door het SDC-OPR-systeem σSMLM ≤ 10 nm voor beelddiepte tot 9 μm met smalle verdelingen. Inderdaad, dubbelwandige filamenteuze microtubulistructuren werden duidelijk opgelost op verschillende dieptes: nabij de grens tussen dekkingglap en cel, op tussenliggende axiale posities, en aan de top van de cel, met piek-tot-piek afstand tussen 30 nm en 40 nm (Figuur 4C), consistent met gerapporteerde waardenvan 24. Deze resultaten benadrukken het vermogen van de SDC-OPR om beeldvorming met hoge resolutie te leveren over grote FOV's en over de gehele celhoogte.
<img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figuur 1: In-vlak single-molecuul lokalisatiemicroscopie van verschillende celmonsters en multicolor superresolutie beeldvorming. (A) Schema van het Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment (SDC-OPR) systeem, met een microlensarray ontworpen om de fotonenverzameling te maximaliseren. (B) Schema van DNA-PAINT: Fluorescentief-gelabelde DNA-strengen, bekend als imagers-strengen, hybridiseren tijdelijk met complementaire DNA-sequenties (dockingstrengen) die verankerd zijn aan het antilichaam/nano dat het eiwit van interesse target. Deze kortstondige bindingsgebeurtenissen genereren fluorescentiesignalen die lijken op stochastisch knipperen. (C) Representatief DNA-PAINT-beeld op het SDC-OPR-systeem met 4× vergroting van de NPC van U2OS-cellen. De mogelijkheid voor hoge resolutie wordt gedemonstreerd in het inset, waar individuele NPC's duidelijk worden opgelost. (D) SDC-OPR-verbeterde DNA-PAINT maakt visualisatie van individuele NPC's mogelijk, waarbij witte pijlen karakteristieke Nup96-eiwitparen binnen de poriearchitectuur markeren. (E) Verdeling van afstandsmetingen tussen Nup96-dimeren (n=16 paren) binnen enkele NPC-symmetrie-eenheden. Deze figuur is aangepast van Zaza et al.14. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 
<img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figuur 2: Exchange-PAINT voor meerkleurige beeldvorming met een SDC-OPR-microscoop. (A) Schema van Exchange-PAINT van drie doelen die sequentieel worden afgebeeld. Drie eiwitdoelen werden gelabeld met ofwel DNA-gefunctionaliseerde antilichamen, Fab-fragmenten of nanobodies. De Cy3B-beeldvormers werden sequentieel gefotografeerd per strengtype met wash-stappen tussen de beeldrondes. (B) Driekleurige Exchange-PAINT-beeldvorming van U2OS-cellen met behulp van SDC-OPR-microscopie met 4× vergroting, met microtubuli (rood; gelabeld met DNA-geconjugeerde anti-α-tubuline), mitochondriën (groen; TOM20-gerichte DNA-nanobodies), en NPC (blauw; mEGFP-gemarkeerd als Nup96 met anti-GFP DNA-nanobodies). Schaalbalk: 5 μm. Het ingezoomde gebied benadrukt de verbeterde resolutie die op het SDC-OPR-systeem is verkregen, met de nadruk op (1) mitochondriën, (2) microtubuli en (3) NUP. Schaalbalken = 1 μm. Deze figuur is aangepast van Zaza et al.14. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figuur 3: DNA-PAINT-beeldvorming binnen grote FOV's op een SDC-OPR-microscoop. Microtubule DNA-PAINT-beelden (anti-α-tubuline-labeling) verkregen bij meerdere vergrotingen: (A) 1× vergroting en 1 binning (FOV van 211 × 211 μm²), (B) 2,8× en 2 binning (FOV van 76 × 76 μm²), (C) 4× vergroting en 4 binning (FOV van 53 × 53 μm²). Kleur geeft de lokalisatieprecisie weer van 0-16 nm in het geval van 1x vergroting en 0-4 nm in de andere. (D) Lokalisatieprecisie gemeten op verschillende afstanden (in μm) vanaf het midden van het gezichtsveld voor 1× (rood), 2,8× (geel) en 4× (groen) vergrotingen. Deze figuur is aangepast van Zaza et al.14. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figuur 4: Whole cell DNA-PAINT beeldvorming. (A) Links. Volumetrische microtubuli-beeldvorming in HeLa-cellen via DNA-PAINT verkregen met SDC-OPR bij 4× vergroting, met axiale doorsneden van z = 0 tot 9 μm (stappen van 1 μm). Elk vlak toont z-positie , lokalisatieprecisie en NeNA-metriek. Schaalbalken: 5 μm (xy). Goed. Lokalisatieprecisie versus penetratiediepte voor alle vliegtuigen. (B) 3D-weergave van het microtubuli-netwerk op dezelfde HeLa-cel als in (A). Kleur geeft de penetratiediepte van 0 tot 9 μm weer (C) Ingezoomde beelden van gemarkeerde kleine gebieden van elke penetratiediepte aangegeven in (A). Deze figuur is aangepast van Zaza et al.14. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Superresolutiebeeldvorming van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

whole-cell-super-resolution-imaging-via-dna-paint-on-spinning-disk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een super-resolutie beeldvorming methode om de structurele organisatie van de bacteriële FtsZ-ring, een essentieel inrichting voor celdeling sonde. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve analyses van fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) beelden en kan worden toegepast op andere bacteriële cytoskeleteiwitten.

Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

We beschrijven hoe de uitvoering fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM)-gebaseerde studies van blaasjes in vaste, gekweekte neuronen. Belangrijke onderdelen van ons protocol etiket voorzien blaasjes met photoconvertible hersenschimmen, het verzamelen van een klein aantal RAW-afbeeldingen met een super-resolutie microscopie-systeem, en de verwerking van de ruwe beelden op de foto om een ​​super-resolutie te produceren.

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Dit protocol beschrijft het nodige eiwit subcellular localisatie om resultaten te verkrijgen op de zebravis netvlies door correleren super resolutie de lichte microscopie en elektronenmicroscopie afbeeldingen scannen.

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

Dit artikel schetst een protocol voor de detectie van een of meer plasma en/of intracellulaire membraaneiwitten grondtoestand uitputting (GSD) Super resolutie microscopie met zoogdiercellen. Hier bespreken we de voordelen en de overwegingen van het gebruik van dergelijke benaderingen voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten.

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Dit protocol legt uit hoe u bacteriële samples voorbereidt en monit voor Live driedimensionale beeldvorming en hoe u de driedimensionale vorm van E. coli van die beelden reconstrueren.

Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

Het keldermembraan is essentieel voor weefsel- en orgaanmorfogenese tijdens de ontwikkeling. Om de mechanismen die leiden tot de juiste plaatsing van deze structuur beter te begrijpen, beschrijft het gepresenteerde protocol methoden om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten in epitheelcellen te visualiseren en te karakteriseren met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.

Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

Superresolutiemicroscopie kan een gedetailleerd inzicht geven in de organisatie van componenten binnen het synaptonemale complex bij meiose. Hier demonstreren we een protocol om individuele eiwitten van het Caenorhabditis elegans synaptonemale complex op te lossen.

Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

Dit protocol beschrijft de geavanceerde beeldvormingstoepassingen en het beheer van gedeelde middelen van een laser-scannend confocaal microscoopsysteem, geïntegreerd met een multiplexed arraydetector voor hoogresolutie cellulaire en subcellulaire beeldvorming. De workflow maakt multimodale beeldvorming mogelijk van confocaal tot superresolutie (~120 nm) binnen één platform, waardoor visualisatie op nanoschaal toegankelijker wordt.

Superresolutie beeldvorming en gedeeld beheer: een protocol voor confocale microscopie met multiplexdetectie

Leer diepe, single-molecule localisatiemicroscopie van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing. Deze methode biedt superresolutie zonder aangepaste optica.

Superresolutiebeeldvorming van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing

Meer video's verkennen