Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen
10 april 2026
Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.
We bestuderen de ontwikkeling van de menselijke endocriene alvleesklier met behulp van oogjes afkomstig van stamcellen om de genetische basis van diabetes te begrijpen. Traditionele niercapsuletransplantatie is zeer invasief. Het intramusculaire transplantatieprotocol biedt een eenvoudiger, reproduceerbaar en minimaal invasief alternatief.
Voeg om te beginnen 0,5 milliliter 5% anti-adherent oplossing toe om de onderkant van een 24-put microwellplaat met omgekeerde piramidevormige microwells te bedekken. Centrifugeer de plaat op 1.300 g gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Onderzoek vervolgens de microwells onder een microscoop op luchtbellen.
Na het opnieuw centrifugeren van de plaat, om eventuele opgesloten lucht te verwijderen, aspireer je de anti-adherente oplossing. Was daarna elke keer goed met 0,5 milliliter PBS en herhaal je de wasstap nog eens. Vervolgens spoel je de gekweekte alvleeskliervoorlopers die zijn ontwikkeld uit hPSC's met één milliliter PBS en 0,5 millimolaire EDTA.
Aspiraat de PBS met 0,5 millimolaire EDTA en bedek de putten met trypsine. Daarna incubeus je bij 37 graden Celsius gedurende acht tot twaalf minuten. Verdun de trypsine met twee volumes DMEM/F12 of PBS en suspendeer de cellen voorzichtig opnieuw door te pipetteren.
Breng de suspensie over naar een kegelvormige buis en ga direct door naar de volgende stap. Centrifugeer de suspensie op 200 g gedurende drie minuten op kamertemperatuur. Aspireer voorzichtig het supernatant en suspendeer de pellet voorzichtig opnieuw in voorverwarmd S4-medium.
Vervolgens aspireer je de PBS uit de microwell-schotels. Voeg voorzichtig 1,25 milliliter van de suspente cellen toe aan elke put van de microwellplaat. Centrifugeer de plaat op 100 g gedurende drie minuten op kamertemperatuur om de cellen gelijkmatig in de microwells te verdelen.
Breng de microwell-plaat voorzichtig over in een bevochtigde broedmachine. Om mediawisselingen met differentiatiemedia uit te voeren, aspireer en doseer je het medium voorzichtig langs de wanden van de put om turbulentie en het verplaatsen van celclusters uit microwells te voorkomen. Na het overbrengen van de juiste hoeveelheid gegenereerde clusters naar een 1,5-milliliter microcentrifugebuis, sluit je de spuit aan op de naaldbuisassemblage en vul je deze met S7-medium.
Aspireer de clusters rechtstreeks vanuit de microcentrifugebuis in de slang. Vouw de buis doormidden en steek het gevouwen gedeelte in een pipettip van 200 microliter. Steek vervolgens de naald van de tip tubing in een 15-milliliter conische buis en bevestig de uiteinden met tape aan de buisrand.
Centrifugeer de buis op 100 g gedurende twee minuten bij 4 graden Celsius om de clusters te verdichten en plaats de buis onmiddellijk op ijs. Om de clusters in de verdoofde NOD scid gammamuizen te transplanteren, schaf je het mediale deel van het rechterbeen onder de knie en desinfecteer je met 70% ethanol. Koppel vervolgens de slang los van de pipettip en sluit deze aan op de spuit.
Knip de buis dicht bij de samengeperste clusters en bevestig deze aan het stompe uiteinde van de naald. Duw de zoutoplossing totdat de eerste cluster de punt van de naald bereikt. Plaats vervolgens de muis op de buik, leunend naar rechts en strek het rechterbeen uit.
Steek de naald vier tot vijf millimeter diep in het mediale compartiment van de rechterdij tussen de adductor en de gracilisspieren. Injecteer vervolgens de clusters terwijl je de naald ongeveer drie millimeter terugtrekt. Draai de spuit, trek de naald eruit en laat de muis herstellen.
Na het herstel van het transplantaat, zes weken na de transplantatie en weefselsectie, voer je immunokleuring uit om daaropvolgende beeldvormende analyses mogelijk te maken. Eencelige suspenties van pancreasvoorlopers van stadium vier werden in microwellplaten geplaatst om groottegecontroleerde driedimensionale aggregaten te genereren. Binnen 24 tot 48 uur vormden zich compacte bolvormige clusters.
Fluorescentiemicroscopie bevestigde de aanwezigheid van PDX1- en insuline-expressieve cellen in hPSC-lijnen van de rapporteur. Na zes weken werd de transplantaatplaats macroscopisch gevisualiseerd, met oogjesachtige massa's die in de spier identificeerbaar waren. Na excisie waren explants onder een stereomicroscoop te identificeren als bleke bolvormige bindstructuren.
Robuuste detectie van C-peptide positieve cellen werd waargenomen bij getransplanteerde dieren. Insulinekleuring bevestigde de aanwezigheid van menselijke bèta-achtige cellen in het transplantaat. Glucagon- en somatostatine-positieve cellen werden gedetecteerd, wat wijst op behoud van alfa- en deltacelpopulaties.
Dit protocol faciliteert functionele assays in vivo en evaluatie van overleving en rijping van getransplanteerde menselijke grafts. De belangrijkste overweging is het waarborgen van hoogwaardige stamceldifferentiatie en een voorzichtige celbehandeling tijdens clustervorming om levensvatbaarheid te maximaliseren en een goede celoverleving te waarborgen. Deze modellen faciliteren het onderzoeken van genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan monogene diabetes en bètaceldysfunctie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit JoVE-artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor intramusculaire transplantatie van uit humane pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleide pancreatische SC-eilanden in immuundeficiënte muizen. De methode biedt een minder invasief alternatief voor transplantatie in het nierscapsule of subcutaan, waardoor eenvoudige chirurgische toegang en betrouwbare terugwinning van het transplantaat mogelijk zijn. Het protocol ondersteunt de beoordeling van de eilandjesfunctie via in vivo glucose-gestimuleerde insuline-secretie (GSIS) na een orale glucosetest en faciliteert daaropvolgende histologische analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Regeneratieve geneeskunde
- Stamceltherapie
- Diabetesonderzoek
Achtergrond
- Uit hPSC afgeleide pancreatische endocriene cellen zijn veelbelovend voor celtherapie bij diabetes en voor ziektemodellering.
- Huidige transplantatielocaties, zoals het nierscapsule of de subcutane ruimte, kennen technische of fysiologische beperkingen.
- In vivo implantatie is vaak vereist om de rijping en functie van uit stamcellen afgeleide eilandjes in een fysiologische context te bestuderen.
- Er is behoefte aan reproduceerbare, toegankelijke transplantatielocaties die het mogelijk maken om het transplantaat terug te halen en de functie te beoordelen.
Doel van de studie
- Het bieden van een gedetailleerd protocol voor intramusculaire transplantatie van hPSC-afgeleide SC-islets in immuundeficiënte muizen.
- Het mogelijk maken van de evaluatie van islet-ingroei, overleving en functie op een minimaal invasieve locatie.
- Het ondersteunen van functionele beoordeling via in vivo GSIS en histologische analyse na transplantatie.
- Het vaststellen van een reproduceerbaar kader voor preklinisch diabetesonderzoek met behulp van stamcelafgeleide islets.
Gebruikte methoden
- Preparatie en compactie van uit hPSC afgeleide pancreatische SC-eilandclusters.
- Intramusculaire transplantatiechirurgie in immuundeficiënte muizen.
- In vivo beoordeling van de glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) na een orale glucosestress.
- Terughalen van het transplantaat en histologische analyse voor evaluatie na transplantatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle ingroei en overleving van hPSC-afgeleide eilandjes op de intramusculaire transplantatieplaats.
- Detectie van functionele insulinesecretie als reactie op een glucoseprovocatie via in vivo GSIS.
- Betrouwbare terugwinning van transplantaten voor histologische analyse ter bevestiging van de eilandjesstructuur en marker-expressie.
- Demonstratie van een reproduceerbare, minimaal invasieve methode voor preklinische studies naar eilandjestransplantatie.
Conclusies
- Intramusculaire transplantatie is een levensvatbare, toegankelijke locatie voor de transplantatie van hPSC-afgeleide eilandjes in muizen.
- De procedure ondersteunt de functionele evaluatie van stamcelafgeleide eilandjes via in vivo GSIS.
- Het terughalen van het transplantaat maakt uitgebreide histologische en moleculaire analyse na transplantatie mogelijk.
- Dit protocol biedt een reproduceerbaar preklinisch model voor de verdere ontwikkeling van celtherapie-onderzoek naar diabetes.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Intramusculaire transplantatie van uit humane pluripotente stamcellen afgeleide pancreatische endocriene cellen biedt een minimaal invasief, reproduceerbaar preklinisch model voor de ontwikkeling van celtherapie bij diabetes. Deze aanpak maakt functionele beoordeling van uit stamcellen afgeleide eilandjes mogelijk via in vivo glucosegestimuleerde insulinesecretie en ondersteunt betrouwbare terughalen van het transplantaat voor verdere analyse, waarmee belangrijke beperkingen van traditionele transplantatieplaatsen worden weggenomen. De methode vergroot de voorspellende betrouwbaarheid bij preklinische evaluatie door een fysiologische context te bieden voor de rijping en functie van de eilandjes, terwijl de chirurgische toegankelijkheid wordt verbeterd en de invasiviteit voor het dier wordt verminderd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de functionele rijping van uit stamcellen afgeleide eilandjes in een fysiologische context te beoordelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door betrouwbare transplantatie en glucose-responsieve insulinesecretie in immuundeficiënte muizen.
- Strategische waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door reproduceerbare functionele read-outs te leveren voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compoundscreening door het vestigen van functionele eilandjestransplantatie.
- Operationele waarde: Standardiseert transplantatieprocedures om reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in preklinische studies te waarborgen.
- Strategische waarde: Verbetert de assay-gereedheid door kwantitatieve functionele outputs mogelijk te maken via in vivo GSIS voor de evaluatie van compoundeffecten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door de menselijke eilandjesfunctie in vivo te modelleren, wat de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Operationele waarde: Waarborgt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie met consistente terughaling van het transplantaat en histologische analyse.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door functionele en structurele gegevens te verschaffen over de ingroei en rijping van de eilandjes.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door hypothesetoetsing in de vroege fase van ontdekking te ondersteunen, assay-standaardisatie voor screening mogelijk te maken en functionele read-outs te leveren die leiden tot lead-identificatie en beslissingen over preklinische verdere ontwikkeling.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests en de verduidelijking van signaalpaden door de eilandjesfunctie op een fysiologische transplantatieplaats te evalueren.
- Screening: Verbetert de assay-gereedheid via gestandaardiseerde transplantatie en reproduceerbare metingen van glucosegestimuleerde insulinesecretie.
- Analytiek: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen via in vivo GSIS om de graftfunctie onder verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door histologische en moleculaire analyse van teruggewonnen grafts mogelijk te maken voor de beoordeling van de rijping.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar preklinisch platform voor iteratieve design-testcycli bij de ontwikkeling van diabetestherapie op basis van stamcellen.
Operationele & Ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in de functie en rijping van uit stamcellen afgeleide eilandjes te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van transplantatieprocedures over verschillende onderzoekslocaties.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare functionele gegevens te leveren, waardoor het biologische risico in een laat stadium in diabetesprogramma's wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde prioritering door reproduceerbare transplantatie en functionele validatie van uit stamcellen afgeleide eilandjes.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamceldifferentiatie, microsurgische transplantatietechnieken en in vivo metabole testen.
- Afhankelijk van steriele chirurgische infrastructuur, glucose-provocatiesystemen en insulinedetectie-assays voor functionele read-outs.
- Vereist cross-team standaardisatie tussen de teams voor celverwerking, chirurgie en analyse om consistente resultaten te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende immuundeficiënte muizenstammen en tijdlijnen voor rijping van de eilandjes.
- Beperkt door de noodzaak van postoperatieve monitoring en procedures voor het terughalen van het transplantaat, wat de doorvoersnelheid bij grootschalige studies kan beïnvloeden.
