Procedures voor de identificatie van SARS-CoV-2 ingangsremmers als potentiële antivirale middelen met MLV-gebaseerde pseudovirussen

Ons onderzoek richt zich op het identificeren van remmers die de toegang tot SARS-CoV-2 blokkeren met behulp van pseudovirussystemen. Het bestuderen van SARS-CoV-2-ingang vereist vaak laboratoria met hoge bioveiligheidsbeheersing, meestal BSL-3. Dit protocol maakt veilige antivirale screening mogelijk die wordt gebruikt in pseudovirussen in een standaard BSL-2 laboratorium.

Om te beginnen plaats je een kweekplaat met zes putten in de bioveiligheidskast en zaad je 7,5 keer 10 per put met een kracht van vijf HEK 293-afgeleide cellen per put in twee milliliter volledig medium. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. De volgende dag bevestig dat de cellen ongeveer 50 tot 60% confluentie hebben bereikt.

De volgende dag bereidt u de polyethylinamine- of PEI-oplossing voor door vijf microliter van één milligram per milliliter PEI-voorraad toe te voegen aan 50 microliter gereduceerd serummedium in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. In een aparte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter bereidt u de DNA-oplossing door 2,5 microgram GFP toe te voegen dat plasmide tot expressie brengt aan 50 microliter van hetzelfde medium. Meng elke buis kort door te vortexen, draai dan vijf seconden naar beneden en incubeer op kamertemperatuur.

Tijdens de incubatieperiode van 10 minuten verwijder je voorzichtig het medium uit elke put van de zes-put plaat zonder de celmonolaag te verstoren en voeg je één milliliter volledig transfectiemedium zonder antibiotica toe aan elke put. Voeg na de incubatie 50 microliter van de DNA-oplossing toe aan de buis met de PEI-oplossing. Meng snel door zes keer te pipetteren en breng precies drie minuten op kamertemperatuur.

Voeg vervolgens snel het PEI DNA-complex druppelgewijs toe aan de bijbehorende put. Sluit nu de randen van de plaat af met parafilm en centrifugeer op 1000 G gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder onderbreking met een schwenkrotor en een plaatbak. Na centrifugatie verwijder je voorzichtig de parafilm en incubeer je de plaat drie uur op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.

Vervang vervolgens voorzichtig het transfectiemedium in elke put door twee milliliter voorverwarmd volledig DMEM-medium. Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 48 uur, en beoordeel de transfectie-efficiëntie door GFP-expressie te evalueren met fluorescentiemicroscopie. Seed HEK 293T leidde cellen af in twee platen met zes putjes, zoals eerder aangetoond is.

Wijs één plaat aan voor de generatie van SARS-CoV-2 spike pseudovirus en de andere voor VSVG pseudovirussen. Bereid de transfectiemix en PEI-DNA-complexen voor op de dag van het experiment en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens de incubatie verwijder je voorzichtig het medium uit elke put van de zes putplaten zonder de celmonolaag te verstoren.

Voeg langzaam één milliliter voorverwarmd volledig transfectiemedium zonder antibiotica toe aan elke put, zodat het medium langs de wand van de put kan lopen. Voeg de voorbereide transfectiecomplexen toe aan de cellen om ze te transfecteren zoals eerder aangetoond te worden. Na 48 uur incubatie na transfectie verzamel je de supernatanten uit elke put in een steriele conische centrifugebuis van 50 milliliter en centrifugeer je op 290 G gedurende zeven minuten bij vier graden Celsius.

Verzamel het celvrije supernatant en filter het door een steriele 0,45 micrometer polyvinylidienfluoride bovenste flesfilterunit. Bereid één milliliter aliquot van het gefilterde supernatant voor en bewaar deze bij min 80 graden Celsius Seed 2,5 keer 10 tot de kracht van vier HSI-cellen, een zeer SARS-CoV-2 gevoelige cellijn in 50 microliter volledige DMEM per put in een 96-wells weefselkweekplaat. Bereid driedubbele putten voor en label voor elke te testen aandoening, inclusief vonkloze pseudovirusinfectie en niet-geïnfecteerde controles.

Incubeer de plaat 's nachts bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Op de dag van transductie ontdooi je één aliquot van elke pseudovirusbatch op ijs en meng je voorzichtig door inversie te mengen, inclusief één aliquot van de spikeless controle. Voeg de benodigde volumes pseudovirusvoorbereiding direct toe aan de aangewezen putten.

Stel het volume van elke put aan op 150 microliter met volledige DMEM. Sluit de plaat nu af met parafilm en centrifugeer op 2.500 G gedurende 45 minuten op kamertemperatuur zonder onderbreking. Verwijder de parafilm-afdichting en incubeer de plaat 72 uur op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.

Na de incubatie bereid je de luciferase-assay-reagentia volgens de instructies van de fabrikant. Ontdooi het luciferasesubstraat en de 5X luciferase-assay lysisbuffer op kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten. Verdun de 5X luciferase-assay lysisbuffer tot 1X met steriel water.

Aspireer voorzichtig en gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 30 microliter 1x lysisbuffer toe aan elke put. Plaats het bord op een schudder en schud het 10 minuten op 150 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur.

Controleer volledige cellyse onder een omgekeerde microscoop om te bevestigen dat cellen volledig gelyseerd zijn en niet te onderscheiden. Vervolgens brengen we de lysaten over op een ondoorzichtige witte plaat met 96 bronnen. Voeg 50 microliter luciferasesubstraat toe aan elke put.

Meng kort door de plaat zachtjes in een cirkelvormige beweging te bewegen en plaats de plaat in de luminometer en meet de luminescentie. Zaad 2,5 keer 10 op de kracht van vier HSI-cellen in 50 microliter volledige DMEM per put in een 96-wellplaat zoals eerder beschreven. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.

De volgende dag bereid één tot drie seriële verdunningen voor van de te testen verbindingen, zoals arbidol, in volledige DMEM met 0,5% dimethylsulfoxide. Met een multikanaals pipet aspireert u het medium voorzichtig uit elke put. Voeg 50 microliter van de bijbehorende verbindingsverdunning toe aan elke put terwijl volledige DMEM alleen aan de kolom 12 controleputten wordt toegevoegd.

Incubeer één uur bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Zonder de verbindingen te verwijderen, voeg direct 50 microliter SARS-CoV-2 spike pseudovirus toe aan elke put die verdund is in een volledig medium met dezelfde verbindingsconcentraties. Sluit het bord af met parfilm.

Centrifugeer op 2.500 G gedurende 45 minuten op kamertemperatuur zonder onderbreking. Na het verwijderen van de parfilm incubeer je de plaat 72 uur op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Tot slot kwantificeer je de infectie met behulp van een luciferase-assay zoals eerder aangetoond.

Transfectie van HEK 293T-afgeleide cellen met vertakte PEI resulteerde in een hoge transfectie-efficiëntie, wat resulteerde in ongeveer 70% GFP-positieve cellen. 48 uur na transfectie. Infectie van vatbare HSI-cellen met afnemende hoeveelheden SARS-CoV-2 spike pseudovirussen of VSVG-pseudovirussen toonde een dosisafhankelijke toename van luminescentie met toenemende pseudovirusinput.

Pseudovirussen zonder spikes en niet-geïnfecteerde cellen vertoonden zeer lage luminescentieniveaus. De verbinding arbidol werd getest op zijn vermogen om pseudovirale toegang te remmen en produceerde duidelijke dosisresponsremming van luciferase-activiteit die wordt opgewekt door spike-pseudovirussen, met minder remming waargenomen bij VSVG-pseudovirussen. De test toonde een Z-primefactor van 0,54, wat aangeeft dat ze geschikt zijn voor screeningsdoeleinden.

Behandeling met arbidol in concentraties beginnend bij 30 micromolair had geen significante invloed op de levensvatbaarheid van de cellen die werden behandeld met alleen 0,5% dimethylsulfoxide-voertuig. Dit protocol maakte de productie van hoogtiter pseudovirussen mogelijk onder geoptimaliseerde omstandigheden. Dit stelt onderzoekers in staat om pseudovirale ingang te meten en verbindingen te identificeren die SARS-CoV-2 spike-gemedieerde infectie remmen.

Hoge transfectie-efficiëntie is cruciaal om hoge titer pseudovirussen te genereren en betrouwbare infectiesignalen te verkrijgen in downstream assays. Dit systeem ondersteunt high-throughput antivirale screening en devaluatie van intreeremmers tegen opkomende SARS-CoV-2-varianten en kan gemakkelijk worden aangepast om pseudovirussen te genereren met envelope-eiwitten van andere virussen.