Genoom-brede mapping van histonmodificaties en bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren in neuro-endocriene kleincellige longkankercellijnen met behulp van CUT&RUN

Het doel van ons onderzoek is dus om de interacties te identificeren tussen transcriptiefactoren die de afstamming definiëren en chromatine-remodellerende eiwitten in de verschillende typen kleincellige longkanker, bij het reguleren van transcriptielandschappen, en hoe deze interacties kunnen bijdragen aan ziekteprocessen, waaronder het ontstaan en progressie van kanker. We streven ernaar dit te bereiken door experimenten uit te voeren zoals CUT&RUN, een next-generation sequencingtechniek die wereldwijd de genomische locaties kan profileren of identificeren waar deze differentieel gemodificeerde histonen en DNA-gebonden transcriptiefactoren zijn. Uiteindelijk hopen we nieuwe routes te identificeren die epigenetisch gereguleerd zijn en therapeutisch toepasbaar kunnen zijn bij de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor patiënten met deze zeer agressieve vorm van longkanker.

Om te beginnen verwijder je de gekweekte kleincellige longkanker neuro-endocriene cellen uit de 37 graden Celsius incubator en bekijk je ze onder een microscoop om hun kwaliteit te waarborgen. Vervolgens breng je de celsuspensatie over in een 50 milliliter conische buis en centrifugeer je de buis op 1.200 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspiraat het medium uit de conische buis met behulp van het vacuüm in de kap en spoel de resulterende celpellet af met 20 milliliter PBS.

Centrifugeer de buis opnieuw op 1.200 g gedurende vijf minuten en aspireer de PBS. Voeg Accutase toe op basis van de korrelgrootte en incubeer drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius om de celpellet te verteren. Vervolgens beëindig je de spijsvertering door vijf milliliter PBS met 10% FBS toe te voegen en te mengen tot een enkele cel suspensie.

Na het opnieuw centrifugeren van de cellen zoals eerder gedemonstreerd, sussen we de pellet opnieuw in vijf milliliter PBS. Tel de startcellen en bevestig hun levensvatbaarheid en integriteit met behulp van de automatische celteller. Bereken het totale aantal benodigde cellen en tel 20% overschot toe om rekening te houden met pipetfouten.

Breng het berekende totale aantal cellen over naar 1,5 milliliter buizen en centrifugeer de buizen op 600 g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Sussen de cellen opnieuw in de wasbuffer met een dichtheid van vijf keer 10 tot de kracht van vijf cellen per reactie, voor in totaal zes reacties. Gebruik per reactie 100 microliter buffer en pipetteer zacht maar grondig om een uniforme suspensie te garanderen.

Centrifugeer de cellen opnieuw, verwijder het supernatant en herhaal de was. Plaats 100 microliter van de gewassen cellen in elke buis van een acht-strip set die 10 microliter geactiveerde Concanavalin A-kralen bevat. Zachtjes pipeten om de inhoud te mengen.

Incubeer de kraalcelslurry 10 minuten op kamertemperatuur om de celbinding aan de kralen mogelijk te maken, en draai de buizen snel in een mini-centrifuge om de slurry op te vangen zonder dat de kralen bezinken. Plaats de buizen op een 0,2 milliliter buismagnetenrack. Laat de slurry opklaren en pipetteer om het supernatant te verwijderen.

Verwijder daarna de buizen van de magneet. Voeg onmiddellijk 50 microliter ijskoude antistofbuffer toe aan elke reactie en pipetteer voorzichtig om de kralen opnieuw te laten ophangen. Label de acht stripbuizen op de juiste manier.

Voeg 0,5 microgram elk van H3K4me3, H3K4me1 en immunoglobuline G-antilichamen en 0,6 microgram E2F7 polyklonale antilichamen uit verschillende bronnen toe aan elke reactiebuis. Pipetteer voorzichtig de inhoud van elke reactiebuis grondig en incubeer deze een nacht op een nutator bij vier graden Celsius met de buisdoppen omhoog. Verwijder de acht stripbuizen uit de nutator en draai snel om vloeistof op de bodem van elke buis op te vangen.

Plaats nu de buizen op de magneetstandaard totdat de slurry weg is. Pipetteer vervolgens voorzichtig om het supernatant te verwijderen en weg te gooien. Terwijl je de buizen op de magneetstandaard houdt, was je elke buis twee keer met 200 microliter koude cel permeabilisatiebuffer en gebruik je na elke wasbeurt een meerkanaals pipet om het supernatant te verwijderen.

Verwijder vervolgens de buizen van de magneetstandaard. Voeg onmiddellijk 50 microliter koudecel-doorlaatbare buffer toe aan elke reactie en pipetteer voorzichtig om de cellen en kralen opnieuw te laten ophangen. Voeg vervolgens 2,5 microliter eiwit AG-micrococcal nuclease toe aan elke reactie en meng goed door zachtjes te pipetten.

Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur, voer je een snelle draai van de buizen uit. Leg ze terug op de magneetstandaard totdat de slurry is verdwenen, en verwijder dan het supernatant. Na het twee keer wassen van de kralen met een koude cel permeabilisatiebuffer, suspendeer je ze voorzichtig opnieuw in 50 microliter van de celdoorlatende buffer.

Terwijl de buizen op ijs worden gelaten, voeg je één microliter 100 millimolair calciumchloride toe aan elke reactie in de acht-buis strip van de vorige stap. Pipette voorzichtig om de kralen volledig te laten ophangen en een efficiënte vertering te bevorderen. Incubeer de buizen op een nutator op vier graden Celsius gedurende twee uur, waarbij de buisdoppen gedurende de hele incubatie omhoog blijven.

Bereid nu in een nieuwe 1,5 milliliter buis de stop buffer-mix voor door 33 microliter stop buffer te combineren met één microliter escherichia coli-piek in DNA van 0,5 nanogram per reactie. Voorzichtig vortexen om de oplossing te mengen. Voeg aan het einde van de twee uur durende incubatie 33 microliter van het voorbereide stopbuffermengsel toe aan elke reactiebuis en meng grondig.

Incubeer de reactiebuizen in een thermocycler bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na een snelle draai plaats je de buizen op een magneetrek totdat de oplossing helder is. Breng voorzichtig ongeveer 85 microliter van het supernatant met het CUT&RUN-release DNA over in verse buisjes van 1,5 milliliter.

Zuiver het teruggevonden DNA, beoordeel de hoeveelheid en voer fragmentgrootteverdeling uit voor kwaliteitscontrole. Daarna gaat u verder met de voorbereiding van CUT&RUN-bibliotheken, kwantificatie, indexed library pooling en paired-end next generation sequencing. Achaete-scute homolog-1 hoge cellijnen, DMS79 en H146, en Neurogenic Differentiation Factor 1 high cellijnen, H82 groeide als niet-hechtende aggregaten of compacte sferoïden in suspensie, terwijl H446 een gemengde morfologie vertoonde, met ongeveer 80% inherente cellen en 20% in suspensie.

CUT&RUN DNA-fragmentanalyse toonde aan dat het enhancer-histonmerk H3K4me1 de hoogste DNA-hoeveelheden gaf over alle cellijnen, gevolgd door H3K4me3, met E2F7 en IgG als de laagste hoeveelheden. Voor geëxtraheerd CUT&RUN-DNA liet de fragmentgrootteverdeling voor H3K4me1 en H3K4me3 duidelijke pieken zien voor mono-nucleosoom en di-nucleosoom, samen met genomisch DNA. Daarentegen werden er geen duidelijke pieken gedetecteerd voor E2F7 of de IgG-controle.

Ondanks lage DNA-invoer werden sequencingbibliotheken van de volgende generatie succesvol gebouwd voor alle CUT&RUN-doelen, inclusief E2F7 en IgG. Heatmap-analyse in DMS79 wildtype en H146 heterozygote mutantcellen toonde aan dat H3K4me3- en E2F7-signalen verrijkt waren nabij transcriptiestartplaatsen, terwijl H3K4me1-signalen breder verspreid waren. Visualisatie van de genoombrowser in een willekeurig geselecteerde chromatineregio liet duidelijke pieken zien voor H3K4me3, H3K4me1 en E2F7, terwijl IgG geen verrijking liet zien.

En daarom hebben wetenschappers en onderzoekers traditioneel chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing of ChIP-seq gebruikt om vragen zoals wij stellen te beantwoorden. ChIP-seq vereist echter een vrij hoge hoeveelheid inputmaterialen, wat niet altijd haalbaar is, afhankelijk van welk model wordt gebruikt. CUT&RUN daarentegen vereist aanzienlijk minder inputmateriaal, zo weinig als 50.000 cellen, en vereist minder sequencing-reads met hoge doorvoersnelheid, wat betekent dat het goedkoper is en veel minder achtergrond produceert bij datageneratie.

CUT&RUN is een techniek die niet alleen op cellen in 2D-kweek kan worden toegepast, maar ook kan worden aangepast voor andere preklinische modellen, zoals patiëntafgeleide organoïden en xenografts. Het kan ook worden gebruikt om het chromatinelandschap in weefsels te profileren, waaronder zowel normaal als ziek weefsel. Dit is dus een ongelooflijk nuttige technologie of techniek voor kankeronderzoekers, maar kan ook erg nuttig zijn voor niet-kankeronderzoekers die zich richten op het bestuderen van verschillende menselijke ziekten.

Dit protocol maakt een mapping mogelijk van histonmodificaties en de blijvende profielen van de diverse eiwitten in situ in het cellulaire genoom. Het leveren van histon-PTM's en de TF-binding over SCLC-subtypes kan subtype-specifieke doelgerichte genen en regulerende elementen aan het licht brengen, zoals enhancers en super-enhancers.