Efficiënte regeneratie-gebaseerde agrobacterium-gemedieerde transformatie van een aseksuele amfibische Brassicaceae-soort, Rorippa aquatica

We pakken het ontbreken van een eenvoudige, schaalbare agrobacterie-transformatiepijplijn voor aseksuele planten aan, waardoor moleculaire analyses van genfuncties mogelijk zijn. Onlangs introduceerden studies in het hele genoom en fysiologische genexpressie rorippa aquatica als model voor heterofiele genexpressie. Het is nuttig bij het bestuderen van de moleculaire basis van de aanpassing van land tot water.

Om te beginnen kies je twee maanden oude boomplanten met gezonde bladeren en volledige randen. Bereid een plantenkweekschaal voor, 20 bij 30 centimeter, met twee lagen autoclavepapieren handdoeken. Vouw de papieren handdoeken netjes en doordrenk ze met steriel water totdat er een dun laagje water op het oppervlak ligt.

Zorg ervoor dat de laboratoriumbank is uitgerust met 100 tot 500 milliliter dubbel gedestilleerd water, steriele containers die geschikt zijn voor het verwachte volume van het geresuspendeerde inoculum, een micropipet en geschikte pipetpunten. Verwijder nu snel 10 bladeren aan de basis van de bloembladen van de geselecteerde stamplanten met een schaar en plaats ze in een petrischaal met steriel water. Na 2,5 uur pipeteert u 50 microliter tenactiv per liter opsussieoplossing om een concentratie van 0,005% tenactiviteit te bereiken.

Draai de kolf voorzichtig om de oplossing te mengen en zorg ervoor dat er een voorbereide propagatietray beschikbaar is voor explantplaatsing na de inenting. Plaats nu een blad met de abaxilzijde naar boven gericht. Met een scalpel snijd je loodrecht langs de middenrib van het blad in stukken van één centimeter en plaats je deze in een buisje van 50 milliliter, geschikt voor gebruik in een roterende buismixer als inoculatie-explant.

Giet het agrobacterium inoculum in de buis met een volume dat voldoende is om al het explantmateriaal volledig te verzadigen. Plaats de buis op een roterende mixer en roer 10 minuten op kamertemperatuur om de inenting uit te voeren. Verwijder vervolgens met een pincet alle geïënfde bladexplants uit de oplossing en plaats ze direct in de voorbereide kweekbak.

Verdeel en verspreid de geweekte explants gelijkmatig zodat ze gedeeltelijk ondergedompeld zijn maar niet volledig ondergedompeld in de dunne laag water bovenop de verzadigde papieren handdoeken. Vervolgens sluit je de propagatiebak af met plasticfolie. Plaats de schalen in een donkere omgeving en broei drie dagen bij een omgevingstemperatuur van 22 graden Celsius.

Controleer na afloop van de donkere incubatieperiode of de trays met transparante plasticfolie verzegeld blijven. Voeg vervolgens dubbel gedestilleerd water toe aan de bakjes om het vochtgehalte te behouden. Breng de inoculatietrays over naar een groeikamer en onderhoud ze onder vegetatieve vermeerdering.

Bekijk visueel geregenereerde rozetplantentjes op geschiktheid voor verplanting. Identificeer ideaal door de aanwezigheid van een intacte goot met meerdere bladeren en wortels van minstens twee tot drie millimeter lengte te bevestigen. Vervolgens worden intacte transgene rosette plantletten met een pincet verwijderd.

Transplanteer de verwijderde plantjes onder dezelfde omstandigheden als voor wildtype klonale regeneraties. Verwijder een aangestoken rozetplant en vermijd zorgvuldig contact met transgene bladeren. Snoei overtollig blad direct rondom het transgene blad en plant één plantje per pot uit.

Na het bemesten van elke verplante plant geef je ze grondig water, besproei je het blad en plaats je de planten onder de juiste omstandigheden. Tot slot breng explant met transformanten terug die geen scheuten en wortels hebben of te klein lijken om te transplanteren naar de propagatietray. Blijf deze explanten screenen en verplant ze zodra ze voldoende zijn gegroeid.

De meeste van een maand oude, onze één T-1 zaailingen, vertoonden chimerische robijnexpressiepatronen, terwijl een klein aantal volledig robijnrode bladeren vertoonde. Een volwassen zes maanden oude zaailingen van een T-1, toonden een chimerische robijnuitdrukking. Chimerische robijn-pigmenteerde bladsectoren die uit onze zaailingen van één T 1 werden verwijderd, konden zich ongeslachtelijk voortplanten.

Verwijderde chimerische bladstukken regenereerden tot volledig robijnexpressief of chimerisch, onze één T één rosette plantjes binnen twee tot vier weken na excisie met zichtbare wortelvorming tijdens regeneratie. Na een maand vertoonden de meeste van onze twee T One-zaailingen overwegend robijnrode bladeren. Ons protocol omzeilt steriele weefselkweekstappen en biedt een transformatieregeneratiepijplijn voor aseksuele planten die vegetatief vermeerderd zijn zonder zaden of bloemen.

Onze studies naar activatie van de ethyleenroute in rorippa aquatica onder water geven belangrijke inzichten in de reacties van terrestrische plantenonderdompeling. Onze methode opent de deur om te onderzoeken hoe licht- en hormoonroutes deze amfibische plant in staat stellen om onder water te metamorfoseren.