Gelokaliseerde RNAi en ectopische genexpressie in de medicinale bloedzuiger

De medische bloedzuiger is een nuttig modelsysteem voor neurobiologische studies vanwege de eenvoud, toegankelijkheid en de mogelijkheid om statisch geïdentificeerde neuronen te bestuderen met vele verschillende experimentele instrumenten, van vroege embryogenese tot op hoge leeftijd. Een bijzonder interessant gebruik van de embryonale bloedzuiger is voor time-lapse-beeldvormingsstudies van neuronale uitlopers in het levende, intacte dier, na zeer nauwkeurige modificaties van de genexpressie in het bestudeerde neuron of de doelcellen daarvan. In deze video demonstreren we een nieuwe technologie voor snelle, nauwkeurige en zeer gelokaliseerde levering van reagentia in de interne lagen van levende embryo's van de bloedzuiger, gebruikmakend van een pneumatisch capillair geweer dat is ontwikkeld in samenwerking tussen het laboratorium van Alex Grossman en ons laboratorium.

Hoewel deze techniek kan worden toegepast voor de aflevering van dubbelstrengs RNA-DNA of elk ander molecuul dat op microscopische gouddeeltjes kan worden geladen, zullen we deze gebruiken voor zowel de knockdown als knock-in van het axonbegeleidingsmolecuul Rin. Hallo, ik kom uit het laboratorium van Eduardo Ano in de Division of Biological Sciences aan de University of California San Diego. Vandaag gaan we u een procedure laten zien voor het uitschakelen (knockdown) of invoegen (knock-in) van de expressie van het axonbegeleidingsmolecuul networking, dat van nature tot expressie komt in de ventrale lichaamswand, maar niet in het dorsale domein van alle lichaamssegmenten van de bloisworm.

We zullen moleculen van dubbelstrengs RNA of plasmide-DNA inbrengen in de lichaamswand en de ganglia van geselecteerde segmenten tijdens vroege ontwikkelingsstadia. Holistische toediening via een pneumatisch capillair pistool is bijzonder belangrijk omdat het de verstoring van genexpressiepatronen in geselecteerde gebieden van een subsegment mogelijk maakt, waarbij de onbehandelde segmenten als interne controle dienen. Bovendien kan het worden gebruikt om interne cellagen in vroege ontwikkelingsstadia te bereiken zonder het weefsel te beschadigen en zonder het specimen te openen.

Ten slotte heeft holistische aflevering het voordeel dat een beperkt aantal cellen op een geselecteerde locatie kan worden gericht, wat een tussenweg vormt tussen single-cell knockdown via micro-injectie en systemische knockdown via genetische benaderingen. Laten we beginnen. De medicinale LE wordt al lang gebruikt om de eigenschappen van zenuwcellen en gedragsgerelateerde neurale circuits te bestuderen vanwege de eenvoud van het centrale zenuwstelsel, dat bestaat uit ongeveer 200 bilaterale paren neuronen en een kleine set reusachtige glia.

Elk segmentaal ganglion van de 21 lichaamssegmenten en elk neuron van de bloedzuiger kan herhaaldelijk worden geïdentificeerd en bestudeerd van exemplaar tot exemplaar, vanaf het vroege embryo tot de oudere volwassene. Sinds de tijd van de farao's is de bloedzuiger gebruikt voor aderlatingen, en het voortdurende gebruik in de geneeskunde maakt hem gemakkelijk verkrijgbaar bij commerciële leveranciers van laboratoriumdieren. Omdat wij echter de ontwikkeling van het zenuwstelsel bestuderen, onderhouden wij in ons laboratorium een kweekkolonie van enkele honderden bloedzuigers, wat ons voorziet van een constante aanvoer van embryo's voor onze experimenten.

IJslcers zijn hermafrodieten. Ze beschikken over zowel vrouwelijke als mannelijke structuren en bevruchten elkaar kruislings. Hierdoor kunnen alle exemplaren eieren leggen.

Zij doen dit in een structuur genaamd de cocon, die zij zelf vervaardigen met behulp van een reeks speciale klieren die zeer interessante polymeren uitscheiden in een deel van het lichaam dat bekend staat als het clitellum. Een regenworm die klaar is om eieren te leggen, graaft zich in het mos, dat wij in tanks aanbieden, en begint deze eivormige cocon rond zijn lichaam te vormen. Wanneer er voldoende materiaal is uitgescheiden en de moleculen zijn begonnen te polymeriseren, deponeert de worm eieren, evenals een voedzame dooier, in de cocon en wiebelt zichzelf eruit. Met een scheermes kunnen we embryo's verwijderen door een venster aan het uiteinde van een cocon open te snijden.

Over het algemeen bevat elke cocon vanaf ongeveer de zesde dag na het begin van de differentiatie 10 tot 20 embryo's. Embryo's kunnen uit de cocon worden gehaald en worden opgekweekt in vijverwater. In deze stadia beginnen we gewoonlijk met onze experimentele studies naar neurale ontwikkeling.

De eerste belangrijke stap in deze procedure is de bereiding van gecoate deeltjes. In deze demonstratie laten we zien hoe gouddeeltjes, gecoat met dubbelstrengs RNA-moleculen van het lech-homoloog van het axon-begeleidingsmolecuul rin, in lech-embryo's kunnen worden afgeleverd. De doelcellen zijn ventrale longitudinale spiercellen in de lichaamswand, waarvan bekend is dat ze Rin tot expressie brengen en vrijgeven vanaf vroege stadia in de Agenesis.

Ons doel is om de natuurlijke expressie in één enkel lichaamssegment zo vroeg mogelijk tijdens de ontwikkeling te reduceren en te observeren hoe dit de categorisering beïnvloedt van neuronen die gevoelig zijn voor deze belangrijke ontwikkelingsfactor. Voor deze stap zijn het sonisatiebad, de vortex, de tafelcentrifuge en de ijsemmer nodig. Daarnaast is 100% isopropanol vereist, welke voor gebruik op ijs geplaatst dient te worden.

Begin met 100 µL bindingsbuffer die 50 mg vault-partikels per mL bevat. Deze partikels zijn ontworpen voor RNAi en gefabriceerd door het bedrijf chell. Verdun vervolgens de partikelloplossing door 100 µL bindingsbuffer toe te voegen, vortex kortstondig en sonicize gedurende één tot twee minuten om de partikels die mogelijk zijn samengeklonterd te scheiden.

Voeg na de twee minuten incubatie vijf tot 10 micrograms dubbelstrengs RNA toe aan de particles, vortex en laat dit twee minuten bij kamertemperatuur staan. Centrifugeer nu, nadat de twee minuten voorbij zijn, de dubbelstrengs RNA-particle-complexen bij minimaal 2.500 RPM in de microcentrifuge gedurende ongeveer 15 seconden.

Om het pellet te verkrijgen, verwijdert u de supernatant en voegt u 750 µL gekoeld isopropanol toe met minimale verstoring van het pellet. Centrifugeer kort in een microcentrifuge en verwijdert u de supernatant na het centrifugeren; suspendeer vervolgens de gouddeeltjes in 100% koud isopropanol door middel van sonicatie. Gebruik kortstondig twee tot drie pulsen in een badsonicator om de deeltjes te scheiden.

Giet het mengsel op een glazen objectglas en laat het oplosmiddel volledig verdampen. De beste resultaten worden behaald wanneer de deeltjes vlak voor de toediening aan het weefsel worden gecoat; we laten u in de volgende stap zien hoe u dit doet. Voordat we overgaan tot de istic-transfectie, bekijken we de experimentele opstelling en hoe deze te prepareren.

Het pneumatische capillaire injectieapparaat is gemonteerd op een micromanipulator voor nauwkeurige aflevering van deeltjes in de embryo's. Het oppervlak van het embryo wordt in beeld gebracht met een videomicroscoop. Een halfgeleiderlaser genereert een lichtstraal die door de binnenste capillair van het apparaat wordt gericht en wordt gebruikt om het doelweefsel te richten.

Aparte Titan-slangen die zijn aangesloten op de drie inlaatopeningen van de kop van het pistool leveren onder druk staand heliumgas vanuit één enkele bron. Eén slang staat altijd open, waardoor een continue stroom heliumgas door het pistool vloeit. De twee andere slangen zijn normaal gesloten door de solenoïdeklep en bevatten goudpartikels met twee verschillende coatings die in de slang zijn geladen.

Als droog poeder. De buitenste capillair van het pistool is verbonden met een vacuümsysteem met een manometerdruk van minus 12,5 PSI. De hoofddruk van hi wordt gevarieerd tussen 10 en 15 PSI om aan te passen aan de gewenste penetratiediepte van de deeltjes.

De heliumkopdruk kan de penetratiediepte van de deeltjes sterk beïnvloeden, evenals de afstand van het embryo tot het pistool. De diameter van de spuiter, die varieert tussen verschillende genenpistolen, moet zorgvuldig worden gekozen in relatie tot het doelgebied. Nu we onze experimentele opstelling hebben laten zien, gaan we ons genenpistool laden en enkele lech-embryo's beschieten.

Voordat de Titan-tubing wordt geladen, is het cruciaal dat de gecoate gouddeeltjes volledig droog zijn. De gecoate gouddeeltjes worden eerst met een dekglas of een scheermesje van de glazen objectglaasjes geschraapt en zijn vervolgens klaar om in het gevouwen stuk weipapier te worden geladen. De tubing moet vlakbij de connector in een U-vorm worden gebogen, zodat de deeltjes tijdens het laden niet over de gehele tubing verspreiden, maar geconcentreerd blijven nabij de connector.

Pak de partikels op met een kleine spatel of een V-vormig stukje weegpapier en vul de tubing. Tik tijdens de vulstap met uw vinger tegen de tubing om de partikels gelijkmatig te verspreiden. Na het vullen van de tubing kunnen we overgaan tot het afleveren van het dubbelstrengs RNA met het Jing gun, maar eerst moeten we de bloedzuigers voorbereiden.

Hier ziet u onze bloedzuigerembryo's, die ongeveer 10 dagen oud zijn. Ze bevinden zich nu in een steriel medium waarin ze zowel voor als na de toediening van dubbelstrengs RNA worden gehouden. De eerste stap bij het voorbereiden van de experimentele embryo's voor de toediening van dubbelstrengs RNA is het toevoegen van een oplossing van 8%ethanol in steriel medium aan een plat stuk flexibel silicone met een V-vormige groef.

Eén embryo wordt toegevoegd en direct voor het afvuren van de partikels met de ventrale zijde naar boven geplaatst. Het medium in de kamer wordt verlaagd tot net onder het bovenste oppervlak van het embryo, en een stukje vloeipapier met een klein gat in het midden wordt erop geplaatst om het te stabiliseren en te voorkomen dat het oppervlak uitdroogt, terwijl tegelijkertijd alleen het gebied wordt blootgesteld dat in het embryonale stadium dat we vandaag gebruiken wordt getarget. In stadium E 10 kunnen de longitudinale spiercellen worden gelokaliseerd op ongeveer 10 tot 20 µm van het buitenste oppervlak, intern ten opzichte van de epidermis, dermis en circulaire spieren.

In tegenstelling tot de spiercellen, bevinden de centrale ganglia aan de ventrale zijde van de embryo's in de embryonale stadia waarin wij werken, E7 tot E12, zich op ongeveer 50 micrometers binnen het ventrale oppervlak van het lichaam. We zullen de heliumdruk aanpassen zodat we mikken op de longitudinale spieren, die zich op een ondiepere diepte bevinden dan de ganglia. Nu zijn we klaar om de longitudinale spieren te beschieten met goudpartikels.

Een hoeveelheid gouddeeltjes van ongeveer een halve milligram kan doorgaans voor maximaal 10 schoten worden gebruikt, waarbij één schot gewoonlijk in de orde van enkele honderden deeltjes aflevert. Een schot wordt gegenereerd door een van de kleppen kortstondig gedurende 0,3 seconden te openen, waardoor een bolus deeltjes vanuit de overeenkomstige slang naar de loop van het pistool wordt geïnjecteerd. Om het betreffende weefselgebied te bestrijken, zijn vaak meerdere schoten vereist.

De buisjes worden tussen de injecties door voorzichtig aangeklopt om sommige deeltjes los te maken en hun injectie in de continue heliumstroom in de loop van het injectieapparaat te vergemakkelijken. Indien men een tweede reagens in dezelfde assay wil toedienen, kunnen alternatieve deeltjes in een tweede buisje worden geladen direct na de toediening van de gouddeeltjes. De embryo's worden teruggeplaatst in kunstmatig vijverwater, bij voorkeur één embryo per schaaltje gedurende één tot drie dagen, totdat RNAi of ectopische expressie als voldoende wordt beschouwd.

Gedurende deze tijd worden de embryo's bewaard in een verduisterde kamer bij kamertemperatuur. Hier volgt een weergave van een ceto-hybridisatie-assay voor narine, Mr.NA knockdown. Er is te zien dat in het behandelde embryo weinig spiercellen terrin tot expressie brengen.

Deze spieren bevatten partikels. Men kan zien dat wanneer de partikels werden gecoat met terrin dubbelstrengs RNA, zij een duidelijk zichtbare knockdown van narin-expressie veroorzaakten die alleen optrad in cellen die partikels bevatten, gewoonlijk één tot twee partikels per cel. Wanneer u partikels coatt met een plasmide dat GFP codeert, ontstaat er fluorescentie in neuronale cellen wanneer deze met de door ons gebruikte pneumatische capillairpistool in hun kernen werden gestopt.

In deze demonstratie waren we in staat om beide deeltjes in cellen te brengen in een klein, gelokaliseerd volume van een levend embryo, zonder detecteerbare schade aan de cellen in het doelgebied te veroorzaken. We hebben u ook laten zien hoe de nomadic capillary gun de techniek van holistische aflevering mogelijk maakt en een nieuwe mogelijkheid biedt om genen in een microscopisch gebied van een weefsel te knock-in en knock-down, waarbij het gebied in drie dimensies is begrensd en met hoge precisie wordt getarget zonder detecteerbare schade aan het weefsel. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.