Name: Gelokaliseerde RNAi en ectopische genexpressie in de medicinale bloedzuiger (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-17T22:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Leer een biolistische aflevermethode met een pneumatisch capillair pistool voor gelokaliseerde RNAi in medicinale bloedzuigerembryo's. Deze techniek maakt precieze genexpressiemanipulatie mogelijk voor neurobiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Dr Michael Baker te bedanken voor zijn hulp bij het genereren van concepten voor gen knock-in en voor het verstrekken van de time-lapse filmpjes van de groeiende zintuiglijke projecties. Wij zouden ook graag Virginia Vandelinder bedanken voor technische bijstand met het pneumatische pistool experimenten.

Deeltjes kunnen worden gecoat met verschillende reagentia, zoals dsRNA moleculen, DNA-plasmiden of kleurstoffen. Het type en de diameter van de deeltjes worden gekozen op basis van het reagens en de diepte van het doel cellen in het weefsel: grotere deeltjes dringen verder, maar kan wat schade aan het weefsel veroorzaken. 1. De voorbereiding van dsRNA gecoate deeltjes <ol><li> Plaats 100% isopropanol op ijs. </li><li> Resuspendeer 5 mg gouddeeltjes (S1600ri, Seashell Technology, LLC; gemiddelde diameter 1,6 micrometer) in 100 ml bindingsbuffer. Wanneer oplossing klaar is, gaat u naar de volgende stap. </li><li> Verdun de oplossing deeltjes door het toevoegen van 100 ul van de bindende buffer, vortex kort en ultrasone trillingen voor 1-2 min om te voorkomen dat klonteren. </li><li> Voeg 5-10μg van dsRNA / siRNA (dsRNA&#39;s / siRNA moet worden opgelost in water tot een concentratie van ~ 1μg/μl). </li><li> Vortex en laat op kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Deze concentratie en tijdsinterval resulteren in siRNA verzadigde gouddeeltjes. </li><li> Pellet het siRNA / goud deeltje complexen door centrifugeren bij ~ 2500 rpm in een bench top centrifuge voor ~ 15 sec. </li><li> Verwijder het supernatant voorzichtig 750 ml koude isopropanol toe te voegen met een minimale verstoring van de pellet. Spin kort en verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de gouddeeltjes in 100 ul koude 100% isopropanol, daarna kort met ultrasone trillingen in een bad ultrasoonapparaat (2-3 pulsen) te breken deeltje agglomeraten. Laatste, giet de zwevende deeltjes op een glasplaatje en laten drogen bij kamertemperatuur. </li></ol> 2. De voorbereiding van de experimentele opstelling voor een specifieke test <ol><li> Elk wapen heeft een andere nozzle opening diameter, variërend van een minimum van ~ 50μm tot ~ 3 mm. De specifieke te worden gebruikt voor het pistool is daarom voor gekozen afhankelijk van het gebied van weefsel worden gericht. </li><li> De druk Hij is aangepast voor de diepte in het weefsel van de doelcellen, in het algemeen tot ~ 100 urn (een hogere druk kan leveren de deeltjes dieper). De afstand tussen het embryo en het uiteinde van het mondstuk beïnvloedt ook de penetratie diepte, als goud deeltjes los momentum in de lucht. </li></ol> 3. Het laden van het geweer met de pre-gecoate deeltjes Deeltjes mogen worden geladen als een droog poeder in de Tygon slang deeltje injectie die verbonden zijn met het spruitstuk. Deze buizen, die moet in een droge atmosfeer worden bewaard bij 4 ° C wanneer deze niet in gebruik is, kan worden hergebruikt in andere experimenten met dezelfde reagentia. Onze experimentele opstelling kunnen tot twee verschillende reagentia per test via verschillende havens in het spruitstuk. <ol><li> Schraap de gedroogde gecoate deeltjes uit de glaasjes met de rand van een glazen deksel slip of een scheermesje voordat u ze in de Tygon slang lijn. Deze Tygon slang wordt specifiek alleen voor deze reagens om kruisbesmetting te voorkomen. </li><li> Als je last van de deeltjes, buig de slang in een U-vorm dicht bij de connector, om de deeltjes te houden van het verspreiden langs de gehele buis en geconcentreerd dicht bij de connector. Pak de deeltjes met een kleine spatel of een stuk van gevouwen papier af te wegen, en de belasting ongeveer de helft van hen in de slang voor elke reeks van embryo&#39;s. Tik op de buis tijdens het laden stap om gelijkmatig verdelen de deeltjes. </li></ol> 4. Dier Voorbereiding Voor en na het goud deeltje levering, worden de embryo&#39;s bewaard in steriel kunstmatige vijver water op kamertemperatuur. <ol><li> Leg de embryo&#39;s, ventrale zijde, in een groef gesneden in een flat, 5mm dik stuk silicone rubber (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) en verdoven ze in een oplossing van 8% ethanol in steriel kunstmatige vijverwater ( jongere embryo&#39;s in stadium E6-E8 kan blijven in kunstmatige vijverwater zonder ethanol gedurende het experiment). </li><li> Onmiddellijk voorafgaand aan het schieten van de deeltjes, hoe lager het bad niveau om het ventrale oppervlak van de embryo&#39;s bloot te leggen door het verwijderen van een deel van de oplossing. Leg een stukje weefsel papier met een klein gat in het midden op de top van om het te stabiliseren en het oppervlak niet uitdrogen. </li></ol> 5. Levering van gecoate deeltjes in het doel weefsel Een lading van de deeltjes kan meestal worden gebruikt voor maximaal tien opnamen, met een enkel schot meestal het waarmaken van de orde van een paar honderd deeltjes. <ol><li> Genereer een schot door het openen van een van de kleppen voor 0,3 s, waardoor de injectie van een bolus van deeltjes uit de bijbehorende slang lijn in het geweer. </li><li> Tik zachtjes tegen de slang tussen de schoten om deeltjes uit de slang muur los en dus ook hun injectie te vergemakkelijken in de Hij stroom van het pistool. </li><li> Ter dekking van het gebied van weefsel van belang, kan meerdere foto&#39;s nodig zijn. </li><li> Na het deeltje levering, plaats de embryo&#39;s terug in kunstmatige vijver, bij voorkeur een embryo per putje in een multi-well plaat. </li></ol> 6. Immunovlekken en neuronale etikettering Houd de embryo&#39;s bij kamertemperatuur en in het donker voor 1 tot 3 dagen na het deeltje aflevering, pas op RNAi (of ectopische expressie) wordt bereikt. We voeren vervolgens een van de volgende procedures op de experimentele monsters en controles: <ol><li> In situ hybridisatie aan test voor de aanwezigheid of afwezigheid van netrine mRNA. Digoxigenine-gelabeld leech netrine riboprobes worden gehybridiseerd om hele leech embryo&#39;s. </li><li> Immunocytochemie te assay voor netrine eiwit en andere eiwitten die uniek zijn voor neuronaal weefsel (zoals anti geacetyleerde tubuline). De procedure wordt ook uitgevoerd op hele-mount embryo&#39;s. </li><li> Micro-injecties van lipofiele kleurstoffen (DII en DIO) in enkele neuronen, voor dye-vult het labelen van de complete cilinders van de neuronen van belang (mechanosensorische druk neuronen in ons geval) in behandelde en controle segmenten. Deze test wordt uitgevoerd op levende embryo&#39;s (intacte of ontleed). </li></ol>

<ol><li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+of+the+receptor+tyrosine+phosphatase+HmLAR2+in+a+single+cell+of+an+intact+leech+embryo+leads+to+growth-cone+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse.</a> Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).</li>
<li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Hirudo+medicinalis+DNA+Promoters+for+Targeted+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).</li>
<li>Gan, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+a+leech+netrin+suggests+roles+in+the+formation+of+longitudinal+nerve+tracts+and+in+regional+innervation+of+peripheral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets.</a> Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).</li>
<li>Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+super+core+promoter+that+enhances+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of a super core promoter that enhances gene expression.</a> Nature Methods. 3, 917-922 (2006).</li>
<li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Applied Physics Letters. 87, 014103(2005).</li>
<li>Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtargeted+gene+silencing+and+ectopic+expression+in+live+embryos+using+biolistic+delivery+with+a+pneumatic+capillary+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun.</a> Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).</li>
</ol>

In deze demonstratie, gebruikten we de pneumatische capillaire gun om gouddeeltjes te leveren in de cellen in kleine lokale volume van een live-bloedzuiger embryo te kloppen in en-down klop genen. De beoogde regio over het algemeen had een diameter van ~ 150 urn en deeltjes werden gevonden ~ 15 micrometer rond het gemiddelde penetratie diepte, die instelbaar is tussen 0 en 50 um. Wanneer de deeltjes werden bekleed met dsRNA moleculen van het axon begeleiding factor netrine, ze veroorzaakt duidelijk zichtbaar knock-down van netrine uitdrukki...

<table><tbody><tr><td>gouddeeltjes</td><td>Overig</td><td>Seashell Technology, LLC</td><td>S1600ri</td><td></td></tr><tr><td>bindingsbuffer</td><td>Reagens</td><td>Seashell Technology, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siliconenrubber</td><td>Reagens</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr></tbody></table>

gelokaliseerde rnai en ectopische genexpressie in de medicinale bloedzuiger

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In deze video, tonen we het gebruik van een pneumatisch capillaire pistool voor de nauwkeurige biolistische levering van de reagentia in levend weefsel. We maken gebruik van de procedure voor verstoren genexpressie patronen in geselecteerde segmenten van de bloedzuiger embryo&#39;s, waardoor de onbehandelde segmenten als interne controles. De pneumatische capillaire pistool kan worden gebruikt om interne lagen van cellen te bereiken in een vroeg stadium van ontwikkeling zonder het openen van het monster. Als een methode voor gelokaliseerde introductie van stoffen in levende weefsels, de biolistische levering met het pistool heeft verschillende voordelen: het is snel, contact-vrije en niet-destructief. Bovendien kan een enkele capillair pistool gebruikt worden voor zelfstandige levering van verschillende stoffen. De levering regio kan hebben zijdelingse afmetingen van ~ 50 tot 150 micrometer en strekt zich uit over ~ 15 micrometer rond het gemiddelde penetratie diepte, dat is instelbaar tussen 0 en 50 um. Deze levering heeft het voordeel van de mogelijkheid om een ​​beperkt aantal cellen doel in een geselecteerde locatie midden houdt tussen enkele cel knock down door micro-injectie en de systemische knockdown door extracellulaire injecties of door middel van genetische benaderingen. Voor kloppen beneden of kloppen in de expressie van het axon begeleiding molecuul netrine, die natuurlijk wordt uitgedrukt door enkele centrale neuronen en in de ventrale lichaam muur, maar niet de rug-domein, leveren wij moleculen van dsRNA of plasmide-DNA in het lichaam muur en centrale ganglia. Deze procedure omvat de volgende stappen: (i) de voorbereiding van de experimentele opstelling voor een specifieke test (het aanpassen van de versnelde druk), (ii) het bekleden van de deeltjes met moleculen van dsRNA of DNA, (iii) het laden van de gecoate deeltjes in het pistool, maximaal twee reagentia in een assay, (iv) de voorbereiding van de dieren voor het deeltje levering, (v) de levering van gecoate deeltjes in het te onderzoeken weefsel (body muur of ganglia), en (vi) de verwerking van de embryo&#39;s (immunokleuring, immunohistochemie en neuronale etikettering) om de resultaten te visualiseren, meestal 2 tot 3 dagen na de bevalling. Wanneer de deeltjes werden bekleed met netrine dsRNA, ze veroorzaakt duidelijk zichtbaar knock-down van netrine uitdrukking die zich alleen in cellen met deeltjes (meestal, 1-2 deeltjes per cel). Deeltjes bedekt met een plasmide coderend voor EGFP geïnduceerde fluorescentie in neuronale cellen wanneer ze gestopt in hun kernen.

In deze video laten we een procedure voor een nauwkeurige biolistische levering van de reagentia in levend weefsel met een nieuw miniatuur gen pistool. We kloppen beneden de uitdrukking van het axon begeleiding molecuul netrine in bloedzuiger embryo&#39;s door het leveren van moleculen van dsRNA in het ventrale lichaam muur en ganglia van de afzonderlijke segmenten.

Gelokaliseerde RNAi en ectopische genexpressie in de medicinale bloedzuiger

In deze video tonen we het gebruik van een pneumatisch capillair pistool voor de nauwkeurige biolistische afgifte van reagentia in levend weefsel. We gebruiken de procedure om ...

De medische bloedzuiger is een nuttig modelsysteem voor neurobiologische studies vanwege de eenvoud, toegankelijkheid en de mogelijkheid om statisch geïdentificeerde neuronen te bestuderen met vele verschillende experimentele instrumenten, van vroege embryogenese tot op hoge leeftijd. Een bijzonder interessant gebruik van de embryonale bloedzuiger is voor time-lapse-beeldvormingsstudies van neuronale uitlopers in het levende, intacte dier, na zeer nauwkeurige modificaties van de genexpressie in het bestudeerde neuron of de doelcellen daarvan. In deze video demonstreren we een nieuwe technologie voor snelle, nauwkeurige en zeer gelokaliseerde levering van reagentia in de interne lagen van levende embryo's van de bloedzuiger, gebruikmakend van een pneumatisch capillair geweer dat is ontwikkeld in samenwerking tussen het laboratorium van Alex Grossman en ons laboratorium.Hoewel deze techniek kan worden toegepast voor de aflevering van dubbelstrengs RNA-DNA of elk ander molecuul dat op microscopische gouddeeltjes kan worden geladen, zullen we deze gebruiken voor zowel de knockdown als knock-in van het axonbegeleidingsmolecuul Rin. Hallo, ik kom uit het laboratorium van Eduardo Ano in d

localized-rnai-and-ectopic-gene-expression-in-the-medicinal-leech

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie...

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

Dit artikel beschrijft drie zenuwstelsel bereidingen met behulp van bloedzuigers: intracellulaire opname van neuronen in ventrale ganglia, het kweken neuronen van ventrale ganglia, en het opnemen van een patch van geïnnerveerde huid sensorische gebieden in kaart.

Intracellulaire opname, Sensory Velden bij, en het kweken geïdentificeerde neuronen in de Leech, Hirudo medicinalis</i

Deze video toont de basisstappen voor het uitvoeren van een volledige transcriptoomanalyse op gedissecteerde vogelembryonale ruggenmergmonsters na transfectie met in ovo elektroporatie.

RNA-Seq Analyse van differentiële genexpressie in Geëlektroporeerde Chick Embryonale Spinal Cord

Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.

Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

RNA-interferentie (RNAi) gebaseerde gen knockdown technieken vormen de kern van Tribolium onderzoek. Hier geven we een overzicht van onze larvale RNAi techniek Tribolium castaneum. Larvale RNAi is een eenvoudige, maar krachtige techniek die een snelle toegang tot verlies-van-functie fenotypes biedt, waardoor onderzoekers om de functie van genen te bestuderen in verschillende contexten.

Larvale RNA interferentie in de Rode Bloem Kever, Tribolium castaneum

In dit werk bieden we een experimentele workflow van hoe actieve enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd.

Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie

We presenteren voorbijgaande transgenese en gen knock-down in doorschijnende zakpijp, een chordate zus groep gewervelde dieren, met behulp van micro-injectie en elektroporatie technieken. Dergelijke methoden vergemakkelijken functionele genomica in dit eenvoudige ongewervelde dat rudimentaire kenmerken van gewervelde dieren, met inbegrip van notochord en hoofd sensorische epitheel, en vele orthologen van de ziekte bij de mens geassocieerde genen beschikt.

Embryo micro-injectie en elektroporatie in de chordate<em&gt; Doorschijnende zakpijp</em

Veel ontwikkelingsbelangrijke genen hebben cel- of weefselspecifieke expressiepatronen. Dit artikel beschrijft LM RNA-seq experimenten om genen te identificeren die differentieel tot expressie worden gebracht op de grens tussen het blad en de schede van maïs en in lg1-R mutanten in vergelijking met het wildtype. De experimentele overwegingen die hier worden besproken, zijn van toepassing op transcriptomische analyses van andere ontwikkelingsverschijnselen.

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van RNA, DNA en eiwit uit hetzelfde monster, in een poging om de variatie te reduceren, reproduceerbaarheid te verbeteren en vergemakkelijken van interpretaties.

Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

RNA interferentie is een breed toepasbare, krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in specifieke ontwikkelingsstadia. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor de implementatie van deze techniek in de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus, van de verwerving van gensequenties tot het knockdownen van genen die de structuur of het gedrag beïnvloeden.

RNA Interferentie in aquatische kevers als een krachtig instrument voor het manipuleren van genexpressie op specifieke ontwikkelingstijdpunten

Hier beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis - en L. donovani-stammen die het gen voor eGFP tot expressie brengen als een stabiel geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. Getransfecteerde parasieten werden gekloond door verdunning te beperken en klonen met de hoogste fluorescentie-intensiteit in beide soorten werden geselecteerd voor verder gebruik in medicijnscreeningtests.

Ontwikkeling van Leishmania-soortenstammen met constitutieve expressie van eGFP

Leer een biolistische aflevermethode met een pneumatisch capillair pistool voor gelokaliseerde RNAi in medicinale bloedzuigerembryo's. Deze techniek maakt precieze genexpressiemanipulatie mogelijk voor neurobiologisch onderzoek.

Gelokaliseerde RNAi en ectopische genexpressie in de medicinale bloedzuiger

Meer video's verkennen