Microbieel DNA-onderzoek in het veld met behulp van een biologische extractie-veldkit en een veld-qPCR-eenheid

De reikwijdte van ons onderzoek omvat echt het uitvoeren van moleculaire analyses die we kunnen gebruiken om microben te karakteriseren die betrokken zijn bij sanering, mijnbouw, corrosiepreventie, en dat helpt ons echt vragen over duurzaamheid te beantwoorden. Dit onderzoek pakt een aantal hiaten in onderzoek en toegankelijkheid aan door gebruik te maken van betrouwbare en in het veld draagbare moleculairbiologische workflows die eenvoudig te gebruiken zijn. Maak beide uiteinden van het filter los en verbind een met lucht gevulde spuit van drie milliliter op het filter via de vergrendelingsluerverbinding.

Duw de lucht erdoor om restwater uit te stoten. Koppel de spuit los en haal meer lucht in voordat je het herhaalt. Daarna zet je de rode uitlaatdop weer dicht.

Draai de oplossing om met een spuit te mengen. Verwijder de Luer-vergrendelingsspuitkap en verbind de Solution A-spuit via de Luer-vergrendelingstip op de ingekapselde 0,2 micrometer filterinlaat. Druk de zuiger in om de Oplossing A langzaam toe te voegen. Schud vervolgens vijf minuten lang krachtig het gesloten filter met de hand.

Draai nu de Solution B-spuit meerdere keren om om te mengen. Verwijder de Luer-vergrendelingsdop en verbind de spuit met de ingesloten filterinlaat via de Luer-vergrendelingstip. Na het opnieuw afsluiten van de inlaatfilterdop, schud je het gesloten filter vijf minuten stevig met de hand.

Verwijder de inlaatkap en draai het filter om. Gebruik een spuit van drie milliliter die aan de ingekapselde filterunit is bevestigd om één milliliter lucht in het filter te duwen. Trek dan aan de zuiger om al het lysaat te verwijderen.

Breng het lysaat over in een vijf-milliliter kraalbuis. Nadat je het met parafilm hebt afgesloten, schud je de kraalbuis vijf minuten krachtig met de hand voordat je hem rechtop zet. Plaats de monstervoorbereidingscartridge op een vlak oppervlak en bevestig een Luer-vergrendelbare kolom aan een spuit van één milliliter.

Gebruik de puntige punt van de kolom om twee gaten in het eerste gedeelte van de monstervoorbereidingscartridge te prikken. Pipetteer één milliliter lysaat uit de kraalbuis in het nieuw gestanste gat in het eerste deel van de cartridge. Steek de spuitkolom terug in het rode gedeelte van de cartridge.

Trek daarna de vloeistof helemaal in de spuit en duw hem vervolgens 10 keer uit. Plaats nu de puntige punt van de spuitkolom boven het rood-oranje gedeelte en prik twee gaten door de foliebarrière. Met de zuiger trek je het volledige spuitvolume helemaal omhoog in de spuit en pomp je de vloeistof helemaal weer uit.

Gebruik op dezelfde manier de spuitkolom om de oranje, gele, blauwe, luchtdroge en groene secties te doorboren en te pompen, waarbij je de zuiger trekt en duwt het aantal keren dat op de sectie staat. Gebruik vervolgens de één-milliliter spuit en de proefvoorbereidingskolom om alle oplossing van het groene gedeelte over te brengen in een goed gelabelde microbuis van één milliliter. Plaats tot drie veldgeëxtraheerde DNA-monsters in de zuivere monstertray van een veldgebaseerd qPCR-instrument, waarbij je één monster per aangewezen sectie kunt garanderen.

Plaats de assaystrips voor elk monster in de bijbehorende A-, B- of C-stripsleuven op de tray, waarbij de eerste put van elke strip wordt uitgelijnd met de eerste gleuf op de tray. Ontgrendel de telefoon en open de applicatie die is vernoemd naar het handelsmerk qPCR-instrument. Wanneer de applicatie opent, tik je op de Start Run-knop.

Op het volgende scherm tik je op de knop 'ID's genereren. Voer voorbeeldinformatie in door te tikken op Sample ID en de naam van het voorbeeld in te typen. Tik op monsterunits en selecteer de juiste eenheid, tik dan onder monsterhoeveelheid en voer het volume in dat tijdens de extractie wordt gebruikt.

Na het invoeren van informatie voor alle monsters, tik je op de knop Doorgaan. Op het volgende scherm tik je op het mappictogram en vervolgens op Opslaan in Huidige Map. Typ een runnaam in en tik op Bevestigen.

Zet het instrument aan door de aan/uit-knop ingedrukt te houden totdat alle voorlichten branden. Tik op Bevestigen in de aanvraag om verder te gaan. Druk op Connect via geïntegreerde korteafstandsdraadloze verbinding in de applicatie.

Druk op de geïntegreerde korteafstandsknop op het instrument totdat het blauwe lampje knippert. Tik dan op Bevestigen en selecteer de naam van het instrument om verbinding te maken. Verwijder de doppen van de go-stripbuizen voor het eerste monster.

Voeg 18 microliter steriel water toe aan elke put en pipetteer voorzichtig om de pellet op te lossen. Voeg twee microliter monster toe aan elke put en sluit de buizen af met rubberen assaystripdoppen, zodat de juiste oriëntatie wordt gegarandeerd. Tik op Bevestigen in de applicatie zodra alle strips klaar zijn.

Verwijder elke assaystrip. Controleer op bellen op de bodem van de putten, en wieg de strook dan voorzichtig tot de bellen omhoog komen. Tik op Bevestigen om verder te gaan.

Open het instrumentdeksel en plaats de assaystrips in de juiste volgorde en oriëntatie in het instrument. Sluit het deksel totdat het vergrendelt en tik op Bevestigen. Tik op de Start Run-knop in de applicatie om de run te starten.

Als de run is afgerond, klik je op E-mail Resultaten. Zodra je verbinding hebt gemaakt met het draadloze internet, tik je op Opnieuw verzenden om de resultaten te verzenden. Maak de tray grondig schoon tussen de runs door om besmetting te voorkomen.

Het succesvolle afronden van DNA-isolatie met behulp van de biologische extractie-veldkit werd bevestigd door consistente qPCR-resultaten in vergelijking met een gevalideerde laboratoriummethode. Standaard kweekverdunning van Dehalococcoides, geanalyseerd met de veldgebaseerde qPCR-eenheid, liet een lage afwijking zien over 10 herhalingen bij zowel 21 graden Celsius als 30 graden Celsius. Precisietests van de veldinstrumenten toonden een relatieve standaardafwijking onder de 5% over alle runs.

Onze bevindingen brengen het veld echt vooruit door milieumonitoring mogelijk te maken op deze afgelegen locaties, en het bevordert echt toegankelijkheid, betrokkenheid van de gemeenschap en zorgt voor zeer impactvol wetenschappelijk onderzoek. Onze resultaten effenden de weg voor het begrijpen van hoe monsters veranderen tijdens verzending versus directe extractie en analyse. Toekomstig onderzoek zal zich richten op het definiëren van de grenzen van deze methoden voor extreme monsters zoals pekel, evenals voor extreme weersomstandigheden.