Methoden voor in situ kwantificering van mitochondriale morfologie in spier- en terminale Schwann-cellen van muizen
10 april 2026
Lokale injecties van een mitochondriale kleurstof, labelen terminale Schwann-celmitochondriën in vivo voor confocale microscopie. Deze methode maakt gebruik van proof of concept aangetoond in skeletspierweefsel van muizen met gezonde of zieke spieren om een hoogresolutie mitochondriale visualisatie te bieden.
Ons onderzoek onderzoekt voor het eerst de mitochondriale morfologie van terminale Schwann-cellen bij de neuromusculaire overgang. Onze aanpak maakt het mogelijk om mitochondriale morfologie te kwantificeren in anders moeilijk te verkrijgbare weefsels, zoals capillaire en lymfebedden. Om te beginnen, verkrijg een wild type en een D2-mdx-muis.
Na het bevestigen van de verdovingsdiepte met een teenknypreflex, steek je de naald in bij de distale pees richting de rechterknie. Injecteer 50 microliter twee-micromolair ver rood fluorescerende mitochondriale kleuring op de tibialis-inwendige, of TA-spier, terwijl de naald langs het injectiepad wordt weggetrokken, en incubeer de kleurstof in vivo gedurende één uur. Gebruik tijdens het verdoving van het dier een schaar en een pincet om de TA-spier te dissectieren en te isoleren voorafgaand aan de euthanasie.
Plaats de geïsoleerde TA-spier in 4% paraformaldehyde op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Verwijder vervolgens onder een stereomicroscoop voorzichtig de vezels door te teasen. Voeg celpermeant nucleïnezuurkleuring toe aan het 4%-paraformaldehyde om een uiteindelijke concentratie van vijf tot tien microgram per milliliter voor nucleaire labeling te verkrijgen.
Was daarna de TA-spier drie keer in PBS gedurende vijf minuten om overtollige kleurstof te verwijderen. Dehydrateer de spier achtereenvolgens in 50%75% en 100% ethanol gedurende elk vijf minuten. Vervolgens incubeer je het monster sequentieel in weefselreinigingsoplossingen één en twee gedurende elk 30 minuten, zodat ze volledig ondergedompeld zijn.
Plaats de spier op een dekmantel. Gebruik een glazen blok van 2,5 bij 2 bij 1 centimeter van 7,8 gram om het voorzichtig plat te maken. Koop een S100 beta-muis.
Na het bevestigen van de verdovingsdiepte met een teenknypreflex, maak een kleine huidincisie boven de gluteus maximus, of GM-spier. Injecteer 75 microliter twee-micromolair rood fluorescerende mitochondriale kleuring onder de GM-spier. Sluit de wond en laat de kleurstof 45 minuten incuberen om selectief terminale Schwann-cellen te labelen.
Terwijl het dier onder narcose blijft, ontleed je de GM-spier binnen 10 minuten en plaats je deze direct in gekoelde 0,9% steriele zoutoplossing. Alleen bij gebruik van D2-mdx muizen, voeg fluorescerende acetylcholinereceptorkleurstof toe met een verdunning van één tot 500 graden aan het microdissectiebad en incubeer het weefsel gedurende 30 minuten. Knip het overtollige vet en bindweefsel af en plaats de GM-spier op een dekmantel met de buikzijde naar beneden voor omgekeerde microscopie.
Voeg twee microliter algemeen montagemedium toe aan het dorsale oppervlak van de GM en plat het weefsel met een glazen blok voordat je beeldvorming neemt. Stel in de software de excitatiegolflengte in op 646 nanometer. Na het toevoegen van twee druppels clearing-oplossing twee, selecteer je de 63X-objectieflens om de TA-spier te fotograferen en stel je de Z-stackdiepte in op bijna 100 micrometer.
Selecteer vervolgens deconvolutiemodus en pas systeemgeoptimaliseerde parameters toe. Stel de stapgrootte in op één micrometer en maak beelden. Om beelden van terminale Schwann-cellen te maken, selecteer je de objectief met een 20-voudige vergroting, stel je de Z-stackdiepte in op ongeveer 17 micrometer en neem je beelden.
Selecteer vervolgens de objectief met een 63-voudige vergroting en maak beelden van individuele terminale Schwann-cellen. Importeer individuele Z-slices om de software te trainen het mitochondriale signaal te herkennen. En voer kwantitatieve analyses uit met behulp van AI-gestuurde software.
Ontwikkel beeldmaskers voor onderzoekers. Splits 3D-beeldstapels in afzonderlijke optische secties volgens algoritmeoptimalisatie. Selecteer elke vijfde Z-schijf uit elke 3D-afbeelding en bereken het gemiddelde per monster.
Standaardiseer beeldvormingsparameters voor alle monsters en kwantificeer mitochondriale morfologie. Voer immunohistochemie en statistische analyses uit om groepsverschillen en correlaties te beoordelen. De mitochondriale connectiviteit was verminderd in de MDX-spier vergeleken met de wildtypemuizen.
Een groter aantal kleine mitochondriale fragmenten en een verminderd aantal grote onderling verbonden mitochondriale netwerken werden waargenomen bij mdx-muizen. Bij wildtypemuizen vertoonden mitochondriën in terminale Schwann-cellen onderling verbonden lusstructuren nabij bifurcaties. Daarentegen leken de mitochondriën bij MDX-muizen gefragmenteerd en ontbraken ze lusvormen nabij bifurcaties.
Confocale en elektronenmicroscopie bevestigden vergelijkbare donutvormige mitochondriale structuren in terminale Schwann-cellen. Postsynaptische analyse toonde sub-sarcolemmale mitochondriën die gegroepeerd waren rond acetylcholinereceptoren, zonder de karakteristieke pretzelachtige structuur. Beeldanalyse toonde aan dat terminale Schwann-celmitochondriën in de MDX-spier een groter oppervlak en fragmentatie vertoonden ten opzichte van wildtypespieren, zonder verschil in relatieve deeltjesgrootte.
Spierkrachtmetingen toonden een verminderde spiertrekking met grotere variabiliteit en een lagere piekkracht in de MDX-spier. De krachtproductie bij toenemende stimulatiefrequenties was ook significant verminderd in MDX-spieren. De mdx-spier vertoonde een verschuiving naar links in vezelgrootte, wat wijst op ongeveer 60% kleinere myovezels vergeleken met het wildtype.
Dit protocol stelt onderzoekers in staat om mitochondriale morfologie in skeletspieren en terminale Schwann-cellen te bestuderen en te kwantificeren. Toekomstige studies kunnen deze aanpak aanpassen om mitochondriale morfologie in microcirculatie en lymfevaten te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een reproduceerbare methode voor het labelen en kwantificeren van de driedimensionale morfologie van het mitochondriale netwerk in hele skeletspieren en terminale Schwanncellen (tSCs) bij muizen. Door gebruik te maken van in vivo toediening van een membraanpotentiaalgevoelige mitochondriale kleurstof en standaard confocale microscopie, maakt deze aanpak een gedetailleerde analyse van de mitochondriale architectuur binnen intacte neuromusculaire weefsels mogelijk, waardoor uitdagingen die gepaard gaan met weefselverstoring en anatomische complexiteit worden overwonnen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cellulaire en moleculaire neurowetenschap
- Spierbiologie
- Beeldvorming en microscopie
Achtergrond
- De morfologie van het mitochondriale netwerk is een belangrijke indicator voor de cellulaire gezondheid.
- Het kwantificeren van de mitochondriale architectuur in intacte weefsels is technisch uitdagend.
- Terminale Schwanncellen (tSC's) zijn essentieel voor het onderhoud en de regeneratie van de neuromusculaire overgang.
- tSC's zijn in situ moeilijk te analyseren vanwege hun locatie en gevoeligheid voor weefselverstoring.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een reproduceerbaar protocol voor het labelen en kwantificeren van de mitochondriale morfologie in whole-mount skeletspierweefsel en tSC's.
- Het mogelijk maken van de analyse van mitochondriale netwerken in situ zonder de noodzaak van transgene reporters of gespecialiseerde imagingplatforms.
- Het valideren van de methode in zowel gezond als dystrofisch spierweefsel.
Gebruikte methoden
- In vivo toediening van een membraanpotentiaal-gevoelige mitochondriale kleurstof.
- Snelle weefselverwerking om de mitochondriale structuur te behouden.
- Hoge-resolutie confocale microscopie voor driedimensionale beeldvorming.
- Analyse van beeldstacks om de connectiviteit, het oppervlak en de fragmentatie van het mitochondriale netwerk te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol labelt en kwantificeert met succes mitochondriale netwerken in whole-mount skeletspier en tSC's.
- Validatie in dystrofe en gezonde spieren bevestigt de verwachte verschillen in mitochondriale morfologie.
- De methode is aanpasbaar voor tSC's met gebruik van S100β reportermuizen.
- De analyse kan worden uitgevoerd met apparatuur die gewoonlijk beschikbaar is in universitaire kernfaciliteiten.
Conclusies
- Deze aanpak maakt gedetailleerde analyse van de mitochondriale morfologie in intact neuromusculair weefsel mogelijk.
- Het elimineert de noodzaak voor transgene mitochondriale reporters of gespecialiseerde imaging-platforms.
- Het protocol is aanpasbaar voor andere dunne of oppervlakkig toegankelijke weefsels.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve in situ analyse van de mitochondriale morfologie in spieren en terminale Schwanncellen vult een cruciaal gat in de vroege ontdekking en targetvalidatie voor onderzoek naar neuromusculaire en metabole ziekten. Dit protocol maakt een high-content, reproduceerbare beoordeling van de integriteit van het mitochondriale netwerk binnen intacte weefsels mogelijk, wat het voorspellend vertrouwen in ziekterelevante modellen ondersteunt en risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen faciliteert. De compatibiliteit met standaard imaging-infrastructuur vergroot de toegankelijkheid en schaalbaarheid voor R&D-teams.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van de gezondheid van het mitochondriale netwerk in fysiologisch relevante weefselomgevingen mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door het kwantificeren van netwerkconnectiviteit, oppervlakte en fragmentatie in ziekte- en controlemodellen.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door het onderscheiden van mitochondriale fenotypes in gezonde versus dystrofe spieren.
- Biedt kwantitatieve eindpunten voor hypothesegestuurde analyse van signaalpaden.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde imaging- en kwantificeringsworkflows vast voor mitochondriële morfologie in whole-mount weefsels.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en vergelijking tussen studies.
- Maakt screening mogelijk van interventies die de mitochondriële dynamiek beïnvloeden in toegankelijke weefselsystemen.
- Ondersteunt hergebruik van het platform over meerdere weefseltypen zonder afhankelijkheid van transgene reporters.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt mitochondriale morfologie-eindpunten uit met ziekterelevante weefselcontexten voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Handhaaft continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door analyse in zowel spier- als Schwanncellen mogelijk te maken.
- Levert risico-gecorrigeerde gegevens om de verdere ontwikkeling van mitochondrië-gerichte therapeutica te informeren.
- Faciliteert aanpassing naar aanvullende dunne of oppervlakkig toegankelijke weefsels voor een bredere translationele impact.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door robuuste kwantificering van de mitochondriale morfologie in intacte weefsels mogelijk te maken, wat zowel vroege targetvalidatie als downstream translationeel onderzoek ondersteunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen en het verminderen van mechanische risico's door directe meting van kenmerken van het mitochondriale netwerk.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve imaging-outputs voor assay-ontwikkeling en de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert metrieken voor netwerkconnectiviteit, oppervlakte en fragmentatie voor comparatieve analyse over verschillende experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen de discovery-fase en preklinische fasen door biomarker-afstemming in ziekterelateerde weefsels mogelijk te maken.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een breed aanpasbare workflow die compatibel is met standaard confocale microscopieplatformen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en vermindert mechanistische ambiguïteit in mitochondriaal onderzoek.
- Operationele waarde: Bevordert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gebruik te maken van breed beschikbare imaging-infrastructuur.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en kapitaalefficiëntie door het bieden van robuuste, kwantitatieve eindpunten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van mitochondriaal gerichte programma's over verschillende ziektegebieden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Maakt gebruik van standaard membraanpotentiaal-gevoelige kleurstoffen en beeldvormingsplatforms die gebruikelijk zijn in kernfaciliteiten.
- Vereist standaardisatie van weefselverwerking en beeldvormingsprotocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan andere dunne of oppervlakkig toegankelijke weefsels met minimale wijzigingen in het protocol.
- Afhankelijk van de toegankelijkheid van het weefsel en de compatibiliteit van de kleurstof voor optimale resultaten.
