Methoden voor in situ kwantificering van mitochondriale morfologie in spier- en terminale Schwann-cellen van muizen
10 april 2026
Lokale injecties van een mitochondriale kleurstof, labelen terminale Schwann-celmitochondriën in vivo voor confocale microscopie. Deze methode maakt gebruik van proof of concept aangetoond in skeletspierweefsel van muizen met gezonde of zieke spieren om een hoogresolutie mitochondriale visualisatie te bieden.
Ons onderzoek onderzoekt voor het eerst de mitochondriale morfologie van terminale Schwann-cellen bij de neuromusculaire overgang. Onze aanpak maakt het mogelijk om mitochondriale morfologie te kwantificeren in anders moeilijk te verkrijgbare weefsels, zoals capillaire en lymfebedden. Om te beginnen, verkrijg een wild type en een D2-mdx-muis.
Na het bevestigen van de verdovingsdiepte met een teenknypreflex, steek je de naald in bij de distale pees richting de rechterknie. Injecteer 50 microliter twee-micromolair ver rood fluorescerende mitochondriale kleuring op de tibialis-inwendige, of TA-spier, terwijl de naald langs het injectiepad wordt weggetrokken, en incubeer de kleurstof in vivo gedurende één uur. Gebruik tijdens het verdoving van het dier een schaar en een pincet om de TA-spier te dissectieren en te isoleren voorafgaand aan de euthanasie.
Plaats de geïsoleerde TA-spier in 4% paraformaldehyde op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Verwijder vervolgens onder een stereomicroscoop voorzichtig de vezels door te teasen. Voeg celpermeant nucleïnezuurkleuring toe aan het 4%-paraformaldehyde om een uiteindelijke concentratie van vijf tot tien microgram per milliliter voor nucleaire labeling te verkrijgen.
Was daarna de TA-spier drie keer in PBS gedurende vijf minuten om overtollige kleurstof te verwijderen. Dehydrateer de spier achtereenvolgens in 50%75% en 100% ethanol gedurende elk vijf minuten. Vervolgens incubeer je het monster sequentieel in weefselreinigingsoplossingen één en twee gedurende elk 30 minuten, zodat ze volledig ondergedompeld zijn.
Plaats de spier op een dekmantel. Gebruik een glazen blok van 2,5 bij 2 bij 1 centimeter van 7,8 gram om het voorzichtig plat te maken. Koop een S100 beta-muis.
Na het bevestigen van de verdovingsdiepte met een teenknypreflex, maak een kleine huidincisie boven de gluteus maximus, of GM-spier. Injecteer 75 microliter twee-micromolair rood fluorescerende mitochondriale kleuring onder de GM-spier. Sluit de wond en laat de kleurstof 45 minuten incuberen om selectief terminale Schwann-cellen te labelen.
Terwijl het dier onder narcose blijft, ontleed je de GM-spier binnen 10 minuten en plaats je deze direct in gekoelde 0,9% steriele zoutoplossing. Alleen bij gebruik van D2-mdx muizen, voeg fluorescerende acetylcholinereceptorkleurstof toe met een verdunning van één tot 500 graden aan het microdissectiebad en incubeer het weefsel gedurende 30 minuten. Knip het overtollige vet en bindweefsel af en plaats de GM-spier op een dekmantel met de buikzijde naar beneden voor omgekeerde microscopie.
Voeg twee microliter algemeen montagemedium toe aan het dorsale oppervlak van de GM en plat het weefsel met een glazen blok voordat je beeldvorming neemt. Stel in de software de excitatiegolflengte in op 646 nanometer. Na het toevoegen van twee druppels clearing-oplossing twee, selecteer je de 63X-objectieflens om de TA-spier te fotograferen en stel je de Z-stackdiepte in op bijna 100 micrometer.
Selecteer vervolgens deconvolutiemodus en pas systeemgeoptimaliseerde parameters toe. Stel de stapgrootte in op één micrometer en maak beelden. Om beelden van terminale Schwann-cellen te maken, selecteer je de objectief met een 20-voudige vergroting, stel je de Z-stackdiepte in op ongeveer 17 micrometer en neem je beelden.
Selecteer vervolgens de objectief met een 63-voudige vergroting en maak beelden van individuele terminale Schwann-cellen. Importeer individuele Z-slices om de software te trainen het mitochondriale signaal te herkennen. En voer kwantitatieve analyses uit met behulp van AI-gestuurde software.
Ontwikkel beeldmaskers voor onderzoekers. Splits 3D-beeldstapels in afzonderlijke optische secties volgens algoritmeoptimalisatie. Selecteer elke vijfde Z-schijf uit elke 3D-afbeelding en bereken het gemiddelde per monster.
Standaardiseer beeldvormingsparameters voor alle monsters en kwantificeer mitochondriale morfologie. Voer immunohistochemie en statistische analyses uit om groepsverschillen en correlaties te beoordelen. De mitochondriale connectiviteit was verminderd in de MDX-spier vergeleken met de wildtypemuizen.
Een groter aantal kleine mitochondriale fragmenten en een verminderd aantal grote onderling verbonden mitochondriale netwerken werden waargenomen bij mdx-muizen. Bij wildtypemuizen vertoonden mitochondriën in terminale Schwann-cellen onderling verbonden lusstructuren nabij bifurcaties. Daarentegen leken de mitochondriën bij MDX-muizen gefragmenteerd en ontbraken ze lusvormen nabij bifurcaties.
Confocale en elektronenmicroscopie bevestigden vergelijkbare donutvormige mitochondriale structuren in terminale Schwann-cellen. Postsynaptische analyse toonde sub-sarcolemmale mitochondriën die gegroepeerd waren rond acetylcholinereceptoren, zonder de karakteristieke pretzelachtige structuur. Beeldanalyse toonde aan dat terminale Schwann-celmitochondriën in de MDX-spier een groter oppervlak en fragmentatie vertoonden ten opzichte van wildtypespieren, zonder verschil in relatieve deeltjesgrootte.
Spierkrachtmetingen toonden een verminderde spiertrekking met grotere variabiliteit en een lagere piekkracht in de MDX-spier. De krachtproductie bij toenemende stimulatiefrequenties was ook significant verminderd in MDX-spieren. De mdx-spier vertoonde een verschuiving naar links in vezelgrootte, wat wijst op ongeveer 60% kleinere myovezels vergeleken met het wildtype.
Dit protocol stelt onderzoekers in staat om mitochondriale morfologie in skeletspieren en terminale Schwann-cellen te bestuderen en te kwantificeren. Toekomstige studies kunnen deze aanpak aanpassen om mitochondriale morfologie in microcirculatie en lymfevaten te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overview
This protocol presents a reproducible method for labeling and quantifying three-dimensional mitochondrial network morphology in whole-mount skeletal muscle and terminal Schwann cells (tSCs) in mice. Utilizing in vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye and standard confocal microscopy, the approach enables detailed analysis of mitochondrial architecture within intact neuromuscular tissues, overcoming challenges associated with tissue disruption and anatomical complexity.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular neuroscience
- Muscle biology
- Imaging and microscopy
Background
- Mitochondrial network morphology is a key indicator of cellular health.
- Quantifying mitochondrial architecture in intact tissues is technically challenging.
- Terminal Schwann cells (tSCs) are critical for neuromuscular junction maintenance and regeneration.
- tSCs are difficult to analyze in situ due to their location and sensitivity to tissue disruption.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for labeling and quantifying mitochondrial morphology in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- To enable analysis of mitochondrial networks in situ without the need for transgenic reporters or specialized imaging platforms.
- To validate the method in both healthy and dystrophic muscle tissue.
Methods Used
- In vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye.
- Rapid tissue processing to preserve mitochondrial structure.
- High-resolution confocal microscopy for three-dimensional imaging.
- Image stack analysis to quantify mitochondrial network connectivity, area, and fragmentation.
Main Results
- The protocol successfully labels and quantifies mitochondrial networks in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- Validation in dystrophic and healthy muscle confirms expected differences in mitochondrial morphology.
- The method is adaptable to tSCs using S100β reporter mice.
- Analysis can be performed using equipment commonly available in university core facilities.
Conclusions
- This approach enables detailed analysis of mitochondrial morphology in intact neuromuscular tissues.
- It eliminates the need for transgenic mitochondrial reporters or specialized imaging platforms.
- The protocol is adaptable to other thin or superficially accessible tissues.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ analysis of mitochondrial morphology in muscle and terminal Schwann cells addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuromuscular and metabolic disease research. This protocol enables high-content, reproducible assessment of mitochondrial network integrity within intact tissues, supporting predictive confidence in disease-relevant models and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its compatibility with standard imaging infrastructure enhances accessibility and scalability across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial network health in physiologically relevant tissue environments.
- Supports functional target validation by quantifying network connectivity, area, and fragmentation in disease and control models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing mitochondrial phenotypes in healthy versus dystrophic muscle.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and quantification workflows for mitochondrial morphology in whole-mount tissues.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of interventions affecting mitochondrial dynamics in accessible tissue systems.
- Supports platform reuse across multiple tissue types without reliance on transgenic reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology endpoints with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in both muscle and Schwann cells.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of mitochondrial-targeted therapeutics.
- Facilitates adaptation to additional thin or superficially accessible tissues for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial morphology quantification in intact tissues, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking through direct measurement of mitochondrial network features.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers network connectivity, area, and fragmentation metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow compatible with standard confocal microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Promotes reproducibility and scalability using widely available imaging infrastructure.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted programs across disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Utilizes standard membrane potential–sensitive dyes and imaging platforms common to core facilities.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other thin or superficially accessible tissues with minimal protocol modification.
- Dependent on tissue accessibility and dye compatibility for optimal results.
