Een preklinisch model van synovitis met ex vivo menselijk synoviaal weefsel met behouden functie en architectuur

De belangrijkste vragen die we willen beantwoorden, zijn wat de native synoviale immuunrespons is op infectieuze en inflammatoire stimuli, en hoe dat tot uiting komt in veranderingen in de synoviale structuur? Mijn belangrijkste klinische en onderzoeksfocus ligt op de behandeling van ernstig zwaarlijvige patiënten met RC-artritis in het eindstadium. Vaak is deze patiëntenpopulatie medisch verwaarloosd vanwege hun moeilijkheden bij het vinden van chirurgische behandelingsopties voor hun ziekte.

Om te beginnen, voer een artrotomie en dissectie uit in de operatiekamer. Gebruik een standaard mediale parapatellaire benadering en voer een meer uitgebreide blootstelling uit bij het opereren van een patiënt met morbide obesitas en eindstadiumartrose. Identificeer het voorste synovium en gebruik elektrocauterisatie om het weefsel te dissecteren.

Observeer de knie op tekenen van ontsteking, aangezien patiënten met obesitas een lokale ontstekingsreactie kunnen vertonen die correleert met de bredere ontstekingseffecten van obesitas. Geef het synovium op een steriele manier door aan het onderzoeksteamlid. Plaats de monstercontainer gevuld met koude Dulbecco's PBS of DPBS op ijs en breng het humane voorste synoviale weefsel dat tijdens de totale knieprothese is verkregen, over in de container.

Was het weefsel twee keer in koud DPBS gedurende 10 minuten op een plate rocker. Breng vervolgens het synovium over naar een steriele petrischaal van 10 centimeter of groter onder een Biosafety Level 2 kast. Voeg koud sterieel DMEM met lage glucose met natriumpyruvaat en L-glutamine toe om de schaal voor de helft te vullen.

Identificeer het synoviale weefsel door de parelglanzende intimaal laag zonder deze los te maken. Schik de benodigde hulpmiddelen om minimaal twee technische replica's van drie millimeter biopsie-kernen te verkrijgen. Gebruik iris schaar of een scalpel om het overtollige vet- en stromaweefsel van de gecauteriseerde kant te dissecteren om het synovium te isoleren, waarbij een weefseldiepte van ongeveer vier tot vijf millimeter wordt gehandhaafd.

Ververs het petrischaalmedia indien nodig om het gezichtsveld te behouden. Positioneer het weefsel met de synoviale bekleding naar de borentool. Stabiliseer het weefsel met de niet-dominante hand met behulp van forceps of hemostatische klemmen en boren het weefsel door een stevige loodrechte druk uit te oefenen met zachtjes draaien.

Vervang de biopsiepons na ongeveer 10 tot 15 gebruiken, of wanneer het weefsel tijdens het boren draait om schade aan de intimale bekledingsstructuur te voorkomen. Open een tweede petrischaal en vul deze met vijf tot tien milliliter media met 10%FBS, gekoeld op 37 graden Celsius. Met platte of niet-getande forceps brengt u de kernen over naar de schaal en schudt u voorzichtig gedurende een tot twee seconden om vuil weg te spoelen zonder ze strak vast te klemmen.

Om de bodemput van het Joint Space Analysis System voor te bereiden, voegt u 600 microliters lage glucose DMEM met 10%FBS toe, gekoeld op 37 graden Celsius. Voeg de voertuigregeling of de gekozen behandelingsreagent, zoals LPS of MCP-1, toe aan de bodemput. Selecteer de transwell-porengrootte op basis van het gewenste experimentele resultaat en voeg 300 microliters lage glucose DMEM met 10%FBS toe aan de transwell.

Gebruik steriele forceps om individuele weefselkernen voorzichtig over te brengen naar het media van de transwell, vermijd gebarsten en drijvende kernen. Plaats vervolgens de constructie in een incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende acht tot 72 uur, afhankelijk van de downstream-assays die moeten worden uitgevoerd. Fixeer het synoviale weefsel in 10% neutraal gebufferd formaline.

Snijd het daarna in voor histologische analyse. Na kleuring met hematoxyline en eosine, beeld de weefselsecties af bij 10X en 40X met behulp van lichtveldmicroscopie. Gebruik Photoshop om de intimale bekleding en sublining-regio's in het 40X TIFF-beeld af te bakenen, waarbij niet-doelgebieden, erytrocyten en grote vaten voor latere kwantitatieve analyse worden afgedekt.

Analyseer de uiteindelijke maskers om de dikte, integriteit en cellulairiteit van de intimale bekleding en sublining te kwantificeren. Beoordeel ten slotte de migrerende cellen door middel van flowcytometrie en de oplosbare factoren in het verzamelde media door een enzym-gekoppelde immunosorbentassay. Het synoviale weefsel gekweekt met toenemende doses MCP-1 of LPS vertoonde duidelijke morfologische veranderingen in de intimale bekleding, waaronder een bros intimaal bekleed en een verdikte intimale bekleding met verminderde cellulaire dichtheid in vergelijking met de controle.

MCP-1 en LPS-behandeling veranderden de synoviale cytokinerespons. MCP-1 induceerde pathogene fibroblastmarker podoplanine-expressie in de sublining, terwijl LPS podoplanine verhoogde in zowel de intimale bekleding als de sublining. Migratoire immuuncellen in de bodemput omvatten neutrofielen, NK-cellen, NKT-cellen, T-cellen, B-cellen of dendritische cellen, monocyten of macrofagen en M2-macrofagen.

T-cellen waren de meest voorkomende migrerende immuuncellen. Statistisch gezien was er geen verschil in celmigratie op basis van de stimulus in de bodemput. Osteoprotegerine, een artritis-relevant eiwit, werd gedetecteerd bij 24, 48 en 72 uur in onbehandeld gekweekt artritisch synovium en was significant hoger bij 72 uur dan bij 24 uur.

De expressie van inducibele stikstofmonoxidesynthase in de intimale bekleding was hoog bij controles bij nul uur en was na 24 uur bijna afwezig. De expressie van stikstofmonoxidesynthase werd gehandhaafd wanneer behandeld met N-acetyl cysteïne. Omgekeerd veranderde N-acetyl cysteïne de expressie van matrix metalloproteïnase-9 niet, een marker voor zowel synovitis als potentiële kraakbeenschade.

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de veranderingen in synoviale intimale en sublininglagen te bestuderen, inclusief diepte, cellulairiteit en intactheid