Een vereenvoudigde methode voor agrobacterium-gemedieerde transformatie van Phytophthora palmivora

Dit protocol biedt een eenvoudig, effectief en reproduceerbaar systeem om phytophthora palmivora en phytophthora capsici te transformeren. Om te beginnen neem je een nieuwe LB-boorplaat met antibiotica aanvulling. Voeg 20 microliter LB vloeibare media toe aan het midden van de plaat en schep agrobacteriumcellen van een eerder gekweekte plaat met een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Met de onderkant en vlakke basis van de buis verdeel je de cellen gelijkmatig over de plaat. Breng de plaat een nacht uit bij 28 graden Celsius gedurende ongeveer 16 tot 18 uur. Schep vervolgens de nacht gekweekte agrobacteriumcellen met een pipetpunt van één milliliter.

Sussen de cellen opnieuw in één milliliter agrobacterium-inductiemedium door op en neer te pipetten. Breng de opnieuw gesuspendeerde cellen nu over in een steriele buis van 50 milliliter bedekt met folie en voeg agrobacterium inductiemedium toe. Meet de optische dichtheid van het monster op 600 nanometer en verdun deze met een agrobacterium-inductiemedium om een optische dichtheid van 0,4 te bereiken.

Maak vervolgens het deksel van de met folie bedekte buis los met de bacteriële suspensie. Plaats het op een platformshaker met zachte beweging van ongeveer 70 omwentelingen per minuut. Vul een zeven tot acht dagen oude phytophthora palmivora-plaat met 10 milliliter water dat voorgekoeld is tot vier graden Celsius.

Gebruik een pipettip om zachtjes op het oppervlak te tikken en verwijder alle luchtbellen op het medium. Breng de plaat 15 minuten uit op vier graden Celsius. Daarna zet je het onder licht op kamertemperatuur voor nog eens 15 minuten.

Met een pipet wordt ongeveer zeven tot acht milliliter vrijgegeven zoosporen voorzichtig overgebracht in een steriele centrifugebuis van 15 milliliter zonder de mycelia en sporangia te verstoren. Vervolgens breng je 20 microliter van de zoospore-suspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, en voeg je 180 microliter water toe om de suspensie tienvoudig te verdunnen. Draai de buis één minuut in vortex om de zoösporen te laten zien en gebruik een hemocytometer onder een microscoop om de zoösporen te tellen.

Voeg vijf milliliter van de voorbereide agrobacterium-suspensie toe aan vijf milliliter zoospore-suspensie in een steriele buis met 50 milliliter folie bedekt. Meng de inhoud voorzichtig, maak het deksel van de tube los en laat het twee uur op kamertemperatuur staan. Bereid tijdens de incubatie de AZCA-platen voor.

Zodra het medium is gestold, plaats je één stuk gesteriliseerd Hybond-N+membraan op de plaat en houd je de plaat in het donker. Na twee uur co-incubatie gebruik je een pipettip om 300 microliter van het mengsel op het Hybond-N+membraan te verspreiden, zodat de marges vrij zijn van de vloeistof. Laat de Petrischalen ongeveer 10 minuten onbedekt in de kap zodat het mengsel aan de lucht kan drogen.

Zodra de vloeistof stopt met bewegen op het membraan, bedek je de platen. Breng de bedekte platen twee dagen uit bij 25 graden Celsius in het donker. Na 48 uur incubatie gebruik je gesteriliseerde pincet om het Hybond-N+membraan ondersteboven op de Plich-boorplaat te plaatsen zonder het over het oppervlak van de vijzel te slepen.

Gebruik de platte basis van een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter om voorzichtig over het membraanoppervlak te drukken en te schuiven om volledig contact met het medium te garanderen. Controleer de onderkant van de plaat op luchtbellen en druk hem voorzichtig uit met dezelfde vlakke basis. Bred de plaat uit bij 25 graden Celsius onder een licht- en 12-uur donkercyclus gedurende twee tot drie dagen.

Verwijder na twee tot drie dagen incubatie het membraan met een steriele pincet en blijf de plaat incuberen onder dezelfde licht- en temperatuurcondities. Co-incubatie van phytophthora palmivora zoosporen met agrobacterium tumefaciens EHA 105, die pCB301TOR-GFP expressief uitdrukken, leverde G418-resistente kolonies op Plich-auger aangevuld met 30 microgram per milliliter G418, terwijl er geen kolonies op controleplaten verschenen zonder agrobacterie-infectie. Het aantal G418-resistente transformanten per 10 zoösporen tot de kracht zeven was 55 in experiment één en 50 in experiment twee.

Fluorescentiemicroscopie bevestigde een duidelijk groen fluorescerend eiwitsignaal in phytophthora palmivora-transformanten. Daarnaast werd dit protocol toegepast op phytophthora capsici om succesvol transformanten te genereren die GFP tot expressie brengen. Ons protocol stelt onderzoekers in staat genfuncties te bestuderen, de cellokalisatie van eiwitten te bepalen en de infectiedynamiek van ziekteverwekkers te volgen.

Deze protocollen kunnen een laag percentage vals-positieven genereren en vereisen daarom extra benaderingen om de ware transformanten te bevestigen. De toepassing van dit transformatiesysteem kan worden uitgebreid naar andere oomyceten en schimmels. We zullen ook proberen dit protocol in de toekomst verder te vereenvoudigen.