Een nieuw platform voor in vitro cellulaire stretching en beeldvorming

Ons doel was om een goedkope, door Hoberman geïnspireerde microscoop-compatibele celrekapparaat te ontwikkelen om te onderzoeken hoe mechanische rek de celfunctie beïnvloedt. Dit apparaat stelt onderzoekers in staat om levenscelreacties op mechanische prikkels te bestuderen, waarbij fysiologische systemen zoals een kloppend hart of ademhalende longen worden nagebootst. Om te beginnen waar passend persoonlijke beschermingsmiddelen.

Meng Silgard 184 basis en uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op één in een plastic schaal. Met een tongspatel meng je de ingrediënten krachtig gedurende twee tot drie minuten. Plaats de schaal vervolgens een uur in een ontgassingskamer.

Neem vervolgens de voorbereide 3D-geprinte mallen en voeg 1,3 gram van het PDMS-mengsel toe aan de isotrope mal. Voeg vervolgens 0,5 gram van het PDMS-mengsel toe aan de uniaxiale mal. Verspreid de gel gelijkmatig over de mal en ontgass de gevulde vorm gedurende een uur.

Laat de gel in de mal twee uur lang op een vlak oppervlak bij kamertemperatuur zakken. Daarna droog je de mal een nacht in een oven op 60 graden Celsius. Meng vervolgens deel A en B van NuSil gel 8100 in gelijke verhoudingen.

Meng de gecombineerde gel met silgard 184 crosslinker bij 0,36% van het totale volume om een substraatstijfheid van 13 kilopascal te bereiken. Om een zacht substraat met een stijfheid van 0,3 kilopascal te maken, sla je het toevoegen van de crosslinker over en mix je de oplossing vervolgens 15 minuten in een trommel. Plaats het NuSil-mengsel in een ontgassingskamer en ontgass 30 minuten.

Verwijder nu voorzichtig de PDMS-gel uit de custom mal en leg deze op een 40 millimeter deklaag zonder te scheuren. Plaats vervolgens de PDMS-gel in de spin-coder. Pipette 100 microliter van het NuSil-mengsel op het negatieve gebied van de isotrope PDMS-gel.

Vervolgens pipette je 50 microliter van het NuSil-mengsel op het negatieve oppervlak van de uniaxiale PDMS-gel. Daarna code bij zeven G gedurende 50 seconden. Om een dikte van 100 micrometer te bereiken.

Laat de gecoate gel twee uur lang op een vlak, vlak oppervlak bij kamertemperatuur zakken. Zet de gel in de oven en droog hem een nacht uit op 60 graden Celsius. Zaad nu menselijke luchtwegen, gladde spiercellen in elastische celkweekputten en incubeer onder standaardomstandigheden.

Daarna meng je cellen met de FLIPR Calcium 6-oplossing voor beeldvorming. Voor het meten van de trekkracht wordt de PDMS NuSil gelsubstraten bedekt met een laag fluorescerende kralen als fiduciale markers. Bereid een 0,025%-oplossing voor van één micrometer diameter rode fluorescerende carboxylaat-gemodificeerde microsferen in HBSS.

Met een vortexmixer vortex is de kraaloplossing 10 seconden lang. Daarna pipetteer je 880 microliter van de kraaloplossing naar de isotrope gel. Voeg 420 microliter van de kraaloplossing toe aan de uniaxiale gel.

Na het incuberen van de gel op kamertemperatuur gedurende een uur, verwijder je voorzichtig de kraaloplossing om de verdeling van de kralen te behouden. Gebruik vervolgens een wattenstaafje of laboratoriumdoekje om voorzichtig eventuele restanten van het geloppervlak af te deppen. Gebruik vervolgens een omgekeerde microscoop uitgerust met een camera, lichte motor en een 10x droog objectief.

Stel de excitatie in op 475 bij 40 nanometer en de emissie op 555 bij 50 nanometer. Verkrijg 16-bits beelden met een framerate van twee hertz tijdens stretch-experimenten. Plaats nu isotrope gel op de stretcher en beeld vervolgens de fluorescerende kralen met een omgekeerde microscoop uitgerust met een 10x droog objectief. Maak beelden in de pre-stretch conditie.

Maak continu beelden gedurende het stretchingprotocol in het midden van het substraat. Herfocus de microscoop indien nodig op de uitgerekte positie voordat je beelden maakt. Analyseer de beelden met behulp van aangepaste MATLAB-code gebaseerd op furier tractiekrachtmicroscopie om verplaatsingsvectoren en bijbehorende vlakke rekvelden te berekenen.

Geef de data weer als het gemiddelde van eindproeven. Het toepassen van een verplaatsing van 240 micrometer zorgde ervoor dat fluorescerende kralen radiaal naar buiten verschoven vanuit het centrum. Tractiekrachtmicroscopie toonde een isotrope verplaatsingsveld met vectoren die vanuit het centrum naar buiten uitstraalden en in grootte toenamen met de afstand.

Het isotrope verplaatsingsveld genereerde een homogeen vlak rekveld. Het verhogen van de verplaatsing tot 1000 micrometer resulteerde in verplaatsingsvectoren die in grootte toenamen terwijl de radiale oriëntatie behouden bleef. Het overeenkomstige rekveld bij 1000 micrometer nam toe in magnitude terwijl het radiaal symmetrisch bleef.

In uniaxiale gels die aan een verplaatsing van 250 micrometer worden blootgesteld, waren verplaatsingsvectoren voornamelijk uitgelijnd langs één as, wat consistent is met uniaxiale rek. De spanningsgolfvormen weerspiegelden nauwgezet de geprogrammeerde motorverplaatsingen en bleven gesynchroniseerd over drie herhaalde cycli. Rekwaarden bij maximale verplaatsing bleven consistent over drie onafhankelijke steekproeven.

Het toepassen van een tijdelijke verplaatsing tot 5.555 micrometer produceerde spanningen variërend van meer dan 0,1% tot 12%Een transiënte 0,5%-rek veroorzaakte een toename van intracellulair calcium, wat zich uitte in een hogere fluorescentieintensiteit na rek. Met onze brancard kunnen onderzoekers levende cel calciumbeeldvorming, tractiekrachtmicroscopie uitvoeren en cellulaire mechanische reacties op isotrope of uniaxiale rek kwantificeren. Een cruciale stap is ervoor te zorgen dat gels uitharden op een vlak oppervlak, omdat een ongelijkmatige dikte het substraat uit focus kan verplaatsen en de optische helderheid tijdens live imaging kan verminderen.

Toekomstige studies kunnen stretch-geïnduceerde cytoskeletreoriëntatie, pathologische spanningsaandoeningen die relevant zijn voor astma of longletsel, en over diverse celtypen heen onderzoeken.