Cholinerge ligandafhankelijke modulatie van oxidatieve fosforyleringskoppeling in digonine-permeabiliseerde BE(2)-C neuroblastoomcellen

Het algemene doel van dit experiment is om een methode te demonstreren om mitochondriale bio-energetica in intacte gekweekte neuroblastomcellen te beoordelen met behulp van selectieve permeabilisatie en combinatie van substraatremmers. Traditioneel wordt mitochondriale ademhaling beoordeeld met instrumenten zoals de Oroboros O2K hogeresolutie respirometer, de Clark-type zuurstofelektrode en de Seahorse XF-analyzer. Traditionele methoden die vertrouwen op geïsoleerde of verrijkte mitochondriale fractie uit weefsels of cellen verzwakken vaak de mitochondriale structuur.

Zo toont deze transmissie-elektronenmicroscoopafbeelding van mitochondriën geïsoleerd uit de muiscortex een duidelijk contrast in structurele integriteit, afhankelijk van of de mitochondriën zijn ingekapseld in presynaptische terminals of niet. Mitochondriën die nog steeds ingekapseld zijn in presynaptische uiteinden lijken structureel intact, zoals aangegeven door de cyaanpijlen op deze afbeelding. Daarentegen lijken mitochondriën die niet ingekapseld zijn of geen omringende membraneuze structuur missen, vaak misvormd, zoals weergegeven door de gele pijlen.

De Seahorse Flex-analyzer wordt vaak gebruikt om mitochondriale bio-energetica te bestuderen in zowel gekweekte cellen als geïsoleerde mitochondriën. In gekweekte cel-gebaseerde analyse worden cellulaire architectuur en signaleringsnetwerken behouden. Het plasmamembraan van intacte cellen is echter ondoordringbaar voor veel tricarboxylzuurcyclussubstraten.

Dit beperkt de reikwijdte van metabole analyse ten opzichte van geïsoleerde mitochondriën, die geen plasmamembraanbarrière hebben, maar vaak structurele artefacten vertonen. Beide systemen hebben dus inherente beperkingen. De hier gepresenteerde techniek maakt gebruik van het feit dat het plasmamembraan rijk is aan cholesterol, terwijl het mitochondriale membraan zeer weinig bevat.

Door gebruik te maken van een cholesterolbindend detergent zoals digitonine, kunnen we het plasmamembraan selectief permeabiliseren terwijl het mitochondriale membraan intact blijft. Deze aanpak maakt gecontroleerde binnenkomst van mitochondriale substraten en remmers in de cel mogelijk zonder de integriteit van de organel in gevaar te brengen. Deze techniek maakt functionele analyse van mitochondriën mogelijk in de context van intacte cellen, waarbij het voordeel van een hele celarchitectuur wordt gecombineerd met de toegankelijkheid van geïsoleerde mitochondriale assays.

Begin het experiment met een subconfluente kweekschaal van je cellen. Was de cellen voorzichtig met een steriele fosfaatbuffer. Voeg een passend volume Triton-oplossing toe om de celmonolaag gelijkmatig te bedekken. Na de incubatie verwijder je de schaal en tik of schud je er voorzichtig horizontaal op om de cellen los te maken.

Met een pipet- en pipetregelaar van vijf ml pipetten wordt de celsuspensie meerdere keren omhoog en omlaag gepipeteerd om een klomp los te maken en een enkele celsuspensie te bereiken. Onderzoek de celsuspensie onder een microscoop om te bevestigen dat het een uniforme single-cell suspension is. Tel de cellen met een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.

Pas de celconcentratie zo aan dat 100 microliter van de suspensie ongeveer 10.000 cellen bevat. Geef voorzichtig 100 microliter celophanging in elke put van de Seahorse XF assayplaat. Laat één put leeg om als achtergrondcontrole te dienen tijdens de test.

Incubeer de plaat twee tot drie uur in een celkweekincubator zodat de cellen aan de bodem van de put kunnen hechten. Zodra de cellen zijn aangesloten, voeg je voorzichtig 300 microliter testmedium toe aan elke put. Breng de plaat terug in de broedmachine en laat het een nacht uitbroeden zodat de cellen kunnen stabiliseren en groeien.

Zorg ervoor dat de cellen een uniforme monolaag vormen over de bodem van elke put. Vermijd overbevolking. De cellen moeten confluent zijn, maar niet overconfluent, om optimale assayprestaties te garanderen.

De avond voor het experiment hydrateer je de XFp 24-sensorcartridge door één ml kalibratiebuffer aan elke put toe te voegen. Alternatief kun je fosfaatbuffer-zoutoplossing gebruiken, pH 7,4. Laat de cartridge 's nachts op kamertemperatuur op het bed liggen.

Incubatie in een niet-COT-incubator bij 37 graden Celsius is niet vereist, omdat de cartridge tijdens het laadproces in evenwicht zal komen met kamertemperatuur. Roep alle diepvriesoplossingen en 2x microgliale assaybuffer bij kamertemperatuur. Controleer de pH, die zou 7,4 moeten zijn.

Pas aan indien nodig. Bereid alle substraat- en injectieoplossingen voor en controleer de pH opnieuw. Houd alle oplossingen ijs tot gebruik.

Maak voedselbuizen met de labels A, B, C en D klaar voor de injectiepoorten van de sensorcartridge. Het is het beste om oplossingen te maken die de respectievelijke inhibitoren of substraten voor elke poort bevatten. Met een multikanaals pipet, laad je 50 microliter van elke injectiepoortoplossing voorzichtig in de respectievelijke poorten, A tot D.

Start de Seahorse-bioanalyzer één tot twee uur voor het experiment om de interne broedmachine te laten stabiliseren op 37 graden Celsius. Label elke put en groepeer volgens je experimentele ontwerp en de richtlijnen van Wave Desktop 2.6. Programmeer de bioanalyzer op de juiste mix, gewicht en meetcyclus.

Zie tabel 8 voor referentie. Het is belangrijk om de evenwichtsoptie aan het begin van de meetcyclus uit te schakelen. Het laten zitten ervan verlengt het experiment onnodig en kan de substraten uitputten.

Start de machine. De machine kalibreert eerst de sensorcartridge, wat ongeveer 15 minuten duurt. Begin direct na het plaatsen van de sensorcartridge in kalibratie met het voorbereiden van de celplaat. Aspireer voorzichtig de buffer zonder de cellen te verstoren met ongeveer 700 microliter 1x mitochondriale assaybuffer naar elke put met hechtende cellen, en laat de plaat één minuut rusten om in evenwicht te komen.

Aspireer voorzichtig de buffer uit elke put zonder de hechtende cellen te verstoren. Herhaal de wasmachine drie keer om een volledig medium te garanderen. Voeg parallel 50 microliter mitochondriale assaybuffer toe aan een achtergrondput zonder cellen.

Gebruik de meniscus als visuele referentie voor volumeconsistentie. Aspireer voorzichtig de buffer uit de celhoudende putten, waarbij ongeveer 50 microliter overblijft om de celhydratatie te behouden. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius, ofwel in een waterbad, waarbij je hem boven het wateroppervlak houdt, of in een niet-stalen incubator met een verzadigde atmosfeer om verdamping te voorkomen.

Voeg vlak voordat je in de analyzer laadt 450 microliter voorverwarmde mitochondriale assaybuffer met assaysubstraten, remmers of medicijnen naar behoefte aan elke put, zodat het totale volume op 500 microliter komt. De plaat is nu klaar om de assay uit te voeren met behulp van de gekalibreerde sensorcartridge in de Seahorse bioanalyzer. Eerst voeren we een koppelingsassay uit om de mate van koppeling tussen het elektronentransportsysteem en oxidatieve fosforylering te onderzoeken.

De koppelingstest helpt mitochondriale functie te onderscheiden van disfunctie. In dit diagram van het mitochondriale elektronentransportsysteem tonen we complexe één, drie en vijf specifieke remmers, samen met de knopen voor verschillende substraten zoals pyruvaat of malaat en succinaat, die de elektronen aan het systeem doneren. Deze visualisatie is nuttig om te begrijpen hoe de assay werkt en de rol van verschillende substraten en remmers.

We onderzoeken eerst twee verschillende concentraties digitonine, vijf micromolaire en 10 micromolaire, op hun effectiviteit bij het faciliteren van elektrontransport over het plasmamembraan en het mogelijk maken van de koppelingsassay. In deze test werd het niveau van respiratorische koppeling beoordeeld door sequentieel het zuurstofverbruik te meten in aanwezigheid van succinaat als substraat, en rotenon als complexe remmer. ADP, oligomycine, FCCP en antimycine A werden vervolgens sequentieel geïnjecteerd, en na elke injectie werden OCR-metingen geregistreerd.

Het linkerpaneel toont lijngrafieken die de zuurstofspanning in de transiënte microkamer weergeven. Typisch moet deze waarde tussen 100 en 200 millimeter kwik blijven om detectie binnen het dynamisch bereik van de sensor te waarborgen. Deze datasets zijn gegenereerd met de point-to-point modus in de Agilent Wave-software, die OCR weergeeft als een reeks snelheden over de meetperiode, waardoor dynamische veranderingen kunnen worden weergegeven, met name 10 micromolaire digitonine verhoogde het succinaattransport in vergelijking met vijf micromolaire, wat resulteerde in een lagere zuurstofspanning in de microkamer en dienovereenkomstig een hogere zuurstofopname.

Het plotten van de gegevens uit deze experimenten toonde aan dat basale ademhaling, gemedieerd door complexen twee tot vier, significant hoger was bij 10 micromolair digitonine dan bij vijf micromolair, wat wijst op efficiënter succinaattransport over het permeabiliseerde plasmamembraan bij de hogere concentratie. Op basis van deze observatie, en aangezien 10 micromolaire digitonine optimale permeabilisatie bood, hebben we vervolgens het celaantal verminderd tot 20.000 cellen per put om de basale ademhaling te verlagen. Deze aanpassing zorgde ervoor dat eventuele door medicijnen of substraat geïnduceerde ademhalingsversterking binnen het dynamische detectiebereik van het systeem bleef.

Zodra de digitonineconcentratie en het celaantal waren geoptimaliseerd, werd de volgende koppelingstest uitgevoerd om de effecten van muscarine-agonisten en -antagonisten op mitochondriale ademhaling te evalueren. Een belangrijke bevinding uit deze reeks experimenten was dat in digitonine, onbehandelde cellen, basale ademhaling, gemedieerd door succinaat-gedreven complexen twee tot vier, evenals State-3 en State-3u ademhaling significant verminderd waren. Dit geeft aan dat succinaat niet onder niet-permeabiliseerde omstandigheden in de cel is getransporteerd.

Het uitzetten van de gegevens van meerdere onafhankelijke experimenten toonde aan dat de muscarineantagonist atropine de basale ademhaling, gemedieerd door complexen twee tot vier in neuroblastoomcellen, significant verminderde in vergelijking met de muscarine-agoniste acetylcholine, die een hoog ademingsniveau handhaafde. Bovendien waren zowel State-3 als State-3u ademhaling significant lager in niet-permeabiliseerde cellen dan in permeabiliseerde cellen, wat de effectiviteit van digitonine onderstreept bij het selectief permeabiliseren van het plasmamembraan zonder de mitochondriale functie te verminderen. De elektronenstroomassay evalueert de sequentiële overdracht van elektronen naar de mitochondriale elektronentransportketen, wat helpt mechanismen van mitochondriale disfunctie of modulatie te identificeren.

In de beginfase van de assay werden cellen behandeld met pyruvaat, malaat en FCCP, wat een hoog niveau van niet-gekoppelde ademhaling veroorzaakte, gedreven door complexen één tot vier. De daaropvolgende toevoeging van rotenon remde complex één, verminderde de basale ademhaling en isoleerde activiteit van complex twee tot vier. Hoewel we geen significante verschillen zagen tussen door medicijnen behandelde aandoeningen en controle, was een belangrijke observatie dat succinaat-gedreven State-3u-ademhaling significant lager was in niet-permeabiliseerde cellen, wat wijst op de cruciale rol van digitonine bij het mogelijk maken succinaat in de cel te laten komen.

Samenvattend biedt dit protocol een betrouwbare manier om mitochondriale bio-energetica te bestuderen. Het combineert de fysiologische relevantie van de hele celarchitectuur met de precisie van geïsoleerde mitochondriale assays, waardoor gecontroleerde toediening van substraten en remmers mogelijk wordt gemaakt, terwijl de integriteit van de organel behouden blijft. Door de digitonineconcentratie en celdichtheid te optimaliseren, kunnen onderzoekers nauwkeurige en reproduceerbare metingen bereiken.

Deze aanpasbare aanpak is ideaal voor het onderzoeken van receptorgemedieerde modulatie van mitochondriale functie en biedt een krachtig platform voor ziekteonderzoek en geneesmiddelenontdekking.