Chromatine toegankelijkheidsprofilering bij hele Caenorhabditis elegans L4-larven

Ons onderzoek richt zich op hoe epigenetische regulatie de genexpressie vormt, specifiek hoe chromatine-toegankelijkheid de genactiviteit controleert onder verschillende biologische omstandigheden. ATAC-seq in C.elegans wordt beperkt door zijn beschermende cuticula. Onze protocollen overwinnen deze barrière om betrouwbare analyse van chromatine-toegankelijkheid mogelijk te maken.

Om te beginnen, verkrijg een synchrone populatie van L1-wormen en laat ze 26 uur groeien bij 20 graden Celsius. Bevestig onder de microscoop dat de meeste wormen zich in het L4-stadium bevinden. Haal alle wormen van de platen met M9-buffer en breng ze over in een 1,5 milliliter centrifugeerbuis.

Was de wormen vijf keer met één milliliter steriel water door ze door zwaartekracht te laten bezinken. Breng vervolgens de buis met de wormen over naar een incubator van 25 graden Celsius gedurende 30 minuten om intestinale voedselresten te verwijderen. Neem vervolgens 50 microliter van het wormenpelletje en plaats het in een nieuwe buis.

Om de wormen te lyseren, voeg 200 microliter vers SDS-DTT-buffer toe en meng gedurende exact vijf minuten in een buisrotator. Voeg vervolgens één milliliter koude eierbuffer toe. Draai vervolgens op een picofuge om het supernatant te verwijderen en herhaal dit zes keer.

Voeg daarna 80 microliter vers bereide pronase toe. Gebruik een 200 microliter pipet met gefilterde tips om het wormenpronase-mengsel 70 keer te mengen en incubeer het gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg 800 microliters L15 10% foetaal runderserum medium toe en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 500G op vier graden Celsius.

Na verwijdering van het supernatant, voeg één milliliter L15 10% foetaal runderserum medium toe en centrifugeer zoals eerder aangetoond. Zodra het pelletje drie keer is gewassen, verwijder het supernatant en suspendeer het pelletje opnieuw in 900 microliters L15 10% foetaal runderserum medium. Filtreer vervolgens de suspensie met een 20 micrometer filter.

Centrifugeer de gefilterde celsuspensie gedurende vijf minuten bij 500G op vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het supernatant, waarbij ongeveer 50 microliter overblijft. Voeg 45 microliter vers bereid lyseerbuffer toe en suspendeer het monster voorzichtig opnieuw.

Voeg vervolgens voorzichtig 50 microliter wasbuffer toe zonder het monster te mengen. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 500G op vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en bewaar het monster op ijs.

Tijdens het centrifugeren, bereid per monster de TN5-mix voor door 25 microliter TN5-buffer, 24,8 microliter nuclease-vrij water en 0,2 microliter TN5-enzym te combineren. Na centrifugatie, verwijder het supernatant en bewaar de kernen op ijs. Voeg 50 microliter TN5-mix toe aan het nucleaire pellet.

Pipet het vervolgens zeven keer op en neer om te mengen. Incubeer gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius op een thermisch blok en tik voorzichtig om de 10 minuten op de buis. Na TN5-incubatie, voeg 300 microliters PB-buffer toe en meng door 25 seconden te vortexen op maximale snelheid.

Breng het volledige volume van de buis over in de spinkolom. Centrifugeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur op maximale snelheid. Voeg 750 microliters PE-buffer toe aan de spinkolom en centrifugeer opnieuw.

Gooi vervolgens het supernatant weg met de opvangbuis. Na een lege spin, plaats de kolom in een nieuw gelabelde 1,5 milliliter buis. Voeg 10 microliters EB-buffer bij 37 graden Celsius toe aan het midden van de kolom zonder deze aan te raken.

Laat het een minuut op kamertemperatuur staan. Centrifugeer vervolgens gedurende één minuut op maximale snelheid bij kamertemperatuur. Herhaal vervolgens de elutiestappen om een ​​eindvolume van 20 microliter in EB-buffer te verkrijgen.

Voer een real-time PCR uit om het juiste cyclusversterkingsnummer voor ATAC-bibliotheekversterking in te schatten. Schat het eindversterkingscyclusnummer in door de cyclus te selecteren waarbij het versterkingssignaal 1/3 van zijn maximum bereikt voor elk monster. Voer de laatste versterking uit voor de ATAC-bibliotheek en wijs aan elk monster een ander omgekeerde primer toe en noteer dit.

Versterk elk monster gedurende het geschatte cyclusnummer voor dat monster. Voer de gepresenteerde polymerasekettingreactie uit in 200 microliter buisjes met 10 microliter DNA-bibliotheek in een totale reactievolume van 50 microliter. Bewaar de monsters bij min 20 graden Celsius als het protocol wordt onderbroken.

Na het zuiveren van de versterkte bibliotheek, voer capillaire elektroforese uit om het fragmentlengteverdelingspatroon te bekijken. De versterkingscurve die resulteert in een geschatte eindbibliotheeiversterking van minder dan 15 cycli duidt op goed kwaliteitsmateriaal dat geschikt is voor voortzetting. De versterkingscurve die een vertraagde toename vertoont, duidt op materiaal van slechte kwaliteit en mag niet worden voortgezet.

De fragmentlengteverdeling na amplificatie toonde nucleosomale patronen van ongeveer 150 basenparen en 300 basenparen in geldige monsters. Een uitgesmeerd fragmentpatroon duidde op over-tagmentering van DNA, waardoor het monster opnieuw moest worden uitgevoerd. Ons protocol maakt genome-wide chromatinetoegankelijkheidsprofilering mogelijk in hele wormen om te begrijpen hoe omgevingen de genregulatie beïnvloeden.

De belangrijkste uitdaging is het balanceren van wormeninput en TN5-activiteit om onvoldoende of overmatige tagmentering te voorkomen, wat zorgt voor optimale chromatinetoegankelijkheidsprofilering. Deze aanpak biedt mogelijkheden om epigenetische variatie te bestuderen tussen wilde isolaten, omgevingsomstandigheden en zelfs alternatieve soorten.