Laservangstmicrodissectie van paraformaldehyde-gefixeerd muizenleverweefsel voor RNA-analyse

Ons onderzoek richt zich voornamelijk op hepatocyten-gerelateerde pathofysiologie in de context van chronische leverziekten. Dit protocol maakt celisolatie in leverweefselsneetjes en RNA-extractie mogelijk. In tegenstelling tot FFPE, of Paraformaldehyde-fixed of CT-protocol preserve and itegrated, wat precieze micro-discussie en hoogwaardige monsters voor downstream OMI-analyse mogelijk maakt.

Om te beginnen worden de penmembraandia's blootgesteld aan ultraviolet licht binnen vier minuten en 30 minuten. Bedek de slides met 0,1 milligram per milliliter poly-L-lysine en laat ze aan de lucht drogen. Sluit de randen van elke schuif af met een neutrale montagemedium.

Met een RNase-decontaminatiemiddel veegt u alle toegankelijke oppervlakken van de cryostaat en alle gereedschappen schoon. Ik gebruik 75% ethanol. Maak de borstel en het gereedschap grondig schoon.

Stel nu de temperatuur van de cryostaat in op min 20 graden Celsius en laat het stabiliseren. Haal de levermonsters uit mijn min 80 graden Celsius opslag. Plaats de monsters minstens 15 minuten in de cryostatkamer om in evenwicht te komen.

Breng een laag OCT-verbinding van twee tot drie millimeter dik aan op het monsterstadium. Plaats vervolgens het monsterstadium op een snelle vrije plank of in de cryostaatkamer om de compoundlaag vooraf te verharden. Na het aanbrengen van een kleine hoeveelheid OCT-verbinding op de voorgestolde laag, plaats je het evenwichtige weefselblok horizontaal op de verbinding en houd je het 10 tot 15 seconden op zijn plaats.

Vervolgens monteert je de monsterfase met het bevestigde weefselblok op de kop van het cryostatmonster. Plaats nu het mes voorzichtig tussen de klemplaten en de achterplaten aan één kant van de cryostaat. Klem de klemhendel om het mes vast te zetten.

Stel de cryostatdikte in op 10 micrometer. Snijd het weefsel in secties en monteer deze direct op de voorbehandelde penmembraanglaas in de cryostaatkamer, gehouden op min 20 graden Celsius. Ontdooi de dia's 20 minuten op kamertemperatuur.

Was de slides drie keer met RN ACE free PBS vier keer van 10 seconden per was. Voeg gefilterde Mayer's hematoxyline-oplossing toe aan de weefselsecties gedurende vijf tot tien seconden. Was de glaasjes vervolgens drie keer met ribonucleasevrij water gedurende 10 seconden per wasbeurt om de resterende hematoxyline te verwijderen.

Beoordeel de kleur onder een microscoop. Met absorberend papier dep je de dia's droog en laat je ze volledig aan de lucht drogen. Veeg het oppervlak van de laboratoriumbank af met een RNase-decontaminatiemiddel.

Zet de controller aan en laat de microscoop de initialisatie voltooien. Draai de toets met de klok mee van de uit- naar de aan-stand om het lasersysteem te starten. Zet de computer aan en start de laser-capture microdissectiesoftware.

Wacht dan tot de initialisatie voltooid is. Plaats nu een steriele 0,2 milliliter PCR-buis in het verzamelapparaat. Voeg met een pipet 10 microliter protease K digestiebuffer toe aan de kap van de PCR-buis.

Laad het verzamelapparaat in de houder van het microscoopmonster. In het change collector device-venster. Ga naar het referentiepunt aanpassen, pas de camerafocus aan om het referentiepunt duidelijk te kunnen zien en gebruik de pijltjesknoppen om het te centreren indien nodig.

Laad een weefselsectie in de monsterhouder met het weefsel naar beneden en de labelpositie rechts. Selecteer de 10x objectieflen en identificeer interessegebieden met specifieke pathologische kenmerken. Navigeer naar het lasermenu.

Klik op kalibreren, selecteer ja en voltooi de kalibratie. In het laserbedieningspaneel stel je het laservermogen in op 50, het diafragma op vijf en de snelheid op negen. Gebruik vervolgens de grafische werkbalk om een cirkel rond het doelgebied te tekenen.

Selecteer een enkele vorm, druk op start cut om laser-capture microdissectie uit te voeren en positioneer het verzamelapparaat om het gedissectiede weefsel te verzamelen. Om documentatie vast te leggen, afbeeldingen selecteer je bestand en kies je afbeeldingen opslaan om voor- en na-afbeeldingen in het voorkeursformaat op te slaan. Na het verzamelen van de gewenste cellen klik je op ontladen om de collector van het level te verwijderen.

Controleer of er nog 10 microliter protease K-digestiebuffer in de kap zit en vul aan indien nodig. Sluit de buis en vortex hem grondig. Draai daarna de buis kort in een centrifuge.

Bewaar de buis op min 80 graden Celsius tot RNA-extractie. De met hematoxyline gekleurde leversectie op de penglaas werd onder de microscoop voor en na de laseropname-microdissectie gevisualiseerd. Gebieden van belang met microvesiculaire steatose werden nauwkeurig verzameld in de kap van een PCR-buis.

Behoud van intacte cellulaire morfologie. Het totale ribonucleïnezuur dat werd geëxtraheerd uit ongeveer 1000 en 2000 laservangstmicrodissectie-geïsoleerde cellen leverde respectievelijk 110,7 nanogram en 213,3 nanogram op. Alle monsters vertoonden een hoge zuiverheid met absorptie van 260 bij 280 nanometer verhoudingen tussen 1,9 en 2,1.

Gelelektroforese toonde duidelijke 28 s en 18 s ribosomale ribo nucleïnezuurbanden. Bioanalyzerprofielen van ribonucleïnezuur uit slechts 1000 cellen. Geeft een ribonucleïnezuurintegriteitsgetal van 6,7.

Q-R-T-P-C-R voor het huishoudgen Beta actine leverde cyclusdrempelwaarden op variërend van 17 tot 19. De beoordeling door bioanalyzer van sequencingbibliotheken opgebouwd uit 50 nanogram totaal ribonucleïnezuur toonde een karakteristieke piek tussen 300 en 500 basenparen. RNA-sequencing van deze bibliotheken leverde hoogwaardige data op met zowel Q 20- als Q 30-scores, die boven de 90% uitkwamen, en een laag foutpercentage tussen replicaten.

Een belangrijke overweging is het voorkomen van antidegradatie door middel van controlestop, snelle kleuring en rechte omstandigheden tijdens onze bewerking. Door deze procedure te bestellen kan deze worden gebruikt voor realtime PCR en een sequencing met fragmentatie-geoptimaliseerde bibliotheeksleutels. Vastgesteld in levermonsters.

Dit protocol maakt hepatocyten-subgroepprofilering mogelijk en ondersteunt hepatologisch onderzoek gericht op pathologie.