Een protocol voor het oogsten van single-cel suspensie uit muizenhoornvliezen
3 april 2026
Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige single-cell suspensies uit hele muishoornvliezen te verkrijgen via sequentiële vertering met collagenase A en trypsine. Deze methode levert levensvatbare individuele cellen met hoge RNA-integriteit op, waardoor ze compatibel zijn met downstream-toepassingen zoals single-cell RNA-sequencing en flowcytometriey.
Dit protocol introduceert voornamelijk een methode om hoogwaardige enkele cellen te verkrijgen uit intacte muishoornvlieën. Onze methode is levensvatbare single cells met een hoge RNA-integriteit, waardoor ze compatibel zijn met downstream toepassingen zoals single cell op een dikke, dunne en flow-diametrie. Om te beginnen plaats je een zes tot acht weken oude geëuthanaseerde vrouwelijke C57BL6-muis op een steriele dissectietafel.
Na het spoelen van de gesloten oogleden met PBS, gebruik je een oogschaar om een incisie langs de achterpool van de oogbol te maken en plaats je het geïsoleerde oog voorzichtig in een petrischaal met ijskoud supplementair hormonaal epitheelmedium. Na het drie keer spoelen van de oogbol met 1XPBS aangevuld met 5% penicillinestreptomycine, gebruik je een oogschaar en pincet om een incisie te maken van de achterpool naar het hoornvlieslimbus. Verwijder voorzichtig het hoornvlies van de sclera en conjunctiva langs de limbale rand, en verwijder vervolgens met twee paar tangen de lens en iris volledig.
Na het drie keer wassen van het hoornvlinstweefsel in PBS, plaats je het schone weefsel in een nieuwe buis. Voeg één milliliter van vijf milligram per milliliter collagenase A-oplossing toe en snijd het weefsel in fragmenten van ongeveer 0,5 bij 0,5 millimeter met behulp van een oogschaar. Incubeer de buis met de hoornvlinfragmenten met collagenase A-oplossing in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius gedurende een uur.
Controleer het weefsel elke 10 minuten tijdens de spijsvertering. Wanneer er geen grote weefselfragmenten meer zijn, centrifugeer je het monster op 300G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, en aspireer je het supernatant voorzichtig. Daarna susseert u de pellet opnieuw in 200 microliter 0,25% trypsine EDTA-oplossing.
Plaats de buis in een celkweekincubator die op 37 graden Celsius staat gedurende 10 minuten om de resterende weefselfragmenten te verteren. Gebruik tenslotte een P1000-pipet met een brede boring om het mengsel voorzichtig te tritureren en zo een single cell suspension te verkrijgen. Centrifugeer de celsuspensie zoals eerder aangetoond en suspendeer de celpellet opnieuw in PBS met 0,04% BSA.
Bij het tellen van de geïsoleerde hoornvliezen met een hemocytometer bleek dat er in totaal 1,05 keer 10 per kracht van vijf cellen werden verkregen uit acht hoornvlieën met een gemiddelde cellenlevensvatbaarheid van 94,6% en een enkele celverhouding van meer dan 96,3%, wat de geschiktheid voor suspensie voor latere toepassingen bevestigde. Immunofluorescentieanalyse toonde aan dat de celsuspensie 83,5% pan-CK-positieve epitheelcellen, 13,5% keratocaan positieve stromale cellen en ongeveer 3% cellen negatief was voor beide markers. Het RNA dat uit de single cell suspension werd geëxtraheerd, vertoonde een hoge RNA-integriteit van ongeveer 8,8 en een 28S bij 18S ribosomale RNA-ratio van ongeveer 2,15, wat de uitstekende RNA-kwaliteit bevestigde.
Na het verkrijgen van enkele cellen kunnen we de functie van hoornvlierencellen en het verkennen van oppervlaktemarkeringen karakteriseren. Deze omgeving is de studie van cel-tot-cel interacties. Een uitdaging bij deze methode is het vrijwel loskoppelen van het hoornvlies van andere weefsels.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een robuust protocol voor het isoleren van hoogwaardige enkelcel-suspensies uit volledige muishoornvliezen. De methode combineert nauwkeurige weefseldissectie met sequentiële enzymatische digestie, waardoor de preparatie van levensvatbare enkelcellen mogelijk wordt die geschikt zijn voor downstream-toepassingen zoals single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) en flowcytometrie. Het protocol levert een hoog aantal cellen op, een uitstekende levensvatbaarheid en behoudt de RNA-integriteit, wat een gedetailleerde analyse van de cellulaire heterogeniteit van het hoornvlies faciliteert.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Oogheelkunde
- Celbiologie
- Single-cell-analyse
Achtergrond
- Het hoornvlies is de buitenste laag van het oog, essentieel voor het gezichtsvermogen en de homeostase van het oogoppervlak.
- Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) vereist hoogwaardige single-cell suspensies.
- Hoornvliesweefsel is dens en complex, wat de celdissociatie uitdagend maakt.
- Bestaande protocollen resulteren vaak in een lage celviabiliteit of een matige RNA-kwaliteit.
Doel van de studie
- Het vaststellen van een betrouwbaar protocol voor het genereren van enkelcel-suspensies uit intacte muizenhoornvliezen.
- Het waarborgen van een hoge celviabiliteit en RNA-integriteit voor downstream-applicaties.
- Het mogelijk maken van een nauwkeurige identificatie en kwantificering van de belangrijkste celtypen in het hoornvlies.
Gebruikte methoden
- Dissectie van hoornvliezen van geëuthanaseerde C57BL6-muizen.
- Sequentiële enzymatische digestie met behulp van collagenase A en trypsine-EDTA.
- Mechanisch fijnmaalproces en zachte trituratie om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.
- Beoordeling van de celviabiliteit met trypaanblauw-kleuring en telling met een hemocytometer.
- Immunofluorescentiekleuring voor Pancytokeratine (epitheelcellen) en Keratocan (stromale cellen).
- RNA-integriteitsanalyse met behulp van een bioanalyzer.
Belangrijkste resultaten
- Ongeveer 1,05 × 105 cellen verkregen uit acht hoornvliezen.
- Hoge celviabiliteit (94,6%) en ratio van enkelvoudige cellen (96,3%).
- Celcompositie: 83,5% pan-CK-positieve epitheelcellen, 13,5% keratocan-positieve stromale cellen, ~3% negatief voor beide markers.
- RNA integrity number (RIN) van ~8,8 en een 28S/18S rRNA-ratio van ~2,15, wat duidt op een uitstekende RNA-kwaliteit.
Conclusies
- Het protocol produceert betrouwbaar hoogwaardige enkelcel-suspensies uit muizenhoornvliezen.
- De celpreparaten zijn geschikt voor veeleisende downstream-toepassingen, waaronder scRNA-seq.
- Deze methode faciliteert gedetailleerde studies naar de functie van hoornvliescellen en cel-celinteracties.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Hoogwaardige suspensies van enkelvoudige cellen uit muishoorvliezen zijn essentieel voor het bevorderen van oftalmologisch onderzoek in de ontdekkingsfase en het mogelijk maken van cellulaire profilering met een hoge resolutie. Dit protocol pakt een kritiek knelpunt aan bij het prepareren van levensvatbare, RNA-intacte enkelvoudige cellen uit dicht oogweefsel, wat een directe impact heeft op de betrouwbaarheid van downstream enkelcelanalyses. Een robuuste celpreparatie verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van targets en ondersteunt de translationele continuïteit tussen de ontdekkings- en preklinische pipelines.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar de cellulaire heterogeniteit van het hoornvlies op single-cell resolutie mogelijk.
- Ondersteunt functionele target-validatie door de levensvatbaarheid van cellen en de RNA-integriteit te behouden.
- Faciliteert mechanistisch de-risking door nauwkeurige identificatie van celtypen.
- Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de selectie van oogheelkundige targets in een vroeg stadium.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde single-cell suspensies met een hoge viabiliteit voor assay-ontwikkeling.
- Waarborgt reproduceerbaarheid en kwantitatieve output voor downstream single-cell RNA-sequencing.
- Bereidt gevalideerd biologisch materiaal voor voor schaalbare screening-workflows.
- Maakt een betrouwbare evaluatie mogelijk van de effecten van verbindingen op verschillende corneaale celpopulaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante modellen door de natuurlijke diversiteit van hoornvliescellen te behouden.
- Handhaaft de RNA-kwaliteit voor de ontdekking en validatie van translationele biomarkers.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door datacontinuïteit te waarborgen van de ontdekkingsfase tot de preklinische stadia.
- Vermindert biologische ambiguïteit in preklinische oogheelkundige studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol integreert op het grensvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek, waardoor een naadloze overgang mogelijk wordt van weefseldissociatie naar single-cell-analyse en daaropvolgende functionele studies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypotheseonderzoek en het verduidelijken van pathways door middel van high-fidelity single-cell profiling.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve single-cell suspensies voor assay-gereedheid en compound screening.
- Analytiek: Biedt robuuste metrieken voor celviabiliteit, celtype-kwantificering en RNA-integriteit voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Behoudt cellulaire diversiteit en RNA-kwaliteit voor biomarker-afstemming en preklinische validatie.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd protocol dat aanpasbaar is binnen verschillende oogheelkundige onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare single-cell preparaten.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go beslissingen mogelijk en verhoogt de kapitaalefficiëntie in oogheelkundige R&D.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van assets in de ontdekkingsfase.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in dissectietechnieken voor oogweefsel en enzymatische digestietechnieken.
- Toegang tot instrumentatie voor celviabiliteitsassays, immunofluorescentie en RNA-integriteitsanalyse is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan andere soorten dicht weefsel door optimalisatie van het protocol.
- Precisie bij de scheiding van weefsels is cruciaal om contaminatie te voorkomen en de zuiverheid van het monster te waarborgen.
