Hepatitis E Virus Fluorescentiereductie Neutralisatietest voor het meten van neutraliserende antilichaamtiters
22 mei 2026
Er is geen standaard virusneutralisatietest beschikbaar voor het Hepatitis E-virus (HEV), een niet-cytopathisch positief strengs RNA-virus. Hier wordt een fluorescentie-reductie-neutralisatietest (FRNT) beschreven op basis van kwantificering van fluorescerend gelabeld viraal capside-eiwit om de effectiviteit van anti-HEV-antilichamen te evalueren.
Het hoofddoel van de fluorescentiereductie-gebaseerde neutralisatietest is het kwantificeren van het neutralisatiepotentieel van een vaccinkandidaat en antilichamen tegen HEV. De bekende cytopathische aard van HEV beperkt PRND-assay. Dit protocol richt zich op immuno-gebaseerde training van PRND om geïnfecteerde cellen te visualiseren en later te minen - Om te beginnen, tel de vers gesplitste HuH-7-cellen.
Plaats vervolgens een microscopie-kwaliteit glazen deksel in een plaat met 12 putten en zaad 0,2 miljoen cellen per put in één milliliter volledige DMEM aangevuld met 10% FBS. Incubeer de cellen een nacht op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Voeg de volgende dag 500 microliter serumvrije media met 1,8 keer 10 toe aan de kracht van vier genoomkopieën van gezuiverde g1-HEV aan de zaadcellen.
Incubeer bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende een uur. Gebruik 500 microliter DPBS om de cellen drie keer te wassen. Voeg twee milliliter DMEM toe, aangevuld met 2% FBS, aan de putten.
Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 72 uur. Was de cellen drie keer met 500 microliter DPBS en incubeer vijf minuten op kamertemperatuur tussen elke wasbeurt. Voeg 500 microliter 4% paraformaldehyde toe aan de cellen en laat ze 20 minuten op kamertemperatuur incuberen.
Daarna was je de cellen met DPBS zoals eerder gedemonstreerd. Na de laatste wasbeurt incubeer je ze 30 minuten in DPBS op kamertemperatuur. Voeg 250 microliter blokkende oplossing toe met 5% normaal geitenserum, 0,5% runderserumalbumine en 0,3% Triton X100 in DPBS.
Incubeer een uur in een shaker op kamertemperatuur. Verwijder de blokkeringsoplossing en was één keer met 500 microliter DPBS. Voeg vervolgens 250 microliter primaire antistofoplossing toe bij een verdunning van één tot 500.
Breng de cellen een nacht uit op vier graden Celsius. De volgende dag was je de cellen drie keer met DPBS zoals eerder gedemonstreerd. Voeg 100 microliter secundair antilichaam toe bij één-op-1.000 verdunning en incubeer één uur bij kamertemperatuur in een humified kamer.
Voer de wasincubatiecyclus uit zoals eerder gedemonstreerd. Voeg 10 microliter antifade-reagens met DAPI toe aan een glazen glaasje. Bevestig de deksel met cellen die naar het reagens wijzen en vermijd luchtbellen.
Sluit het deksel af met nagellak om het te behouden voor confocale microscopievisualisatie. Tel vers gesplitste HuH-7 cellen. Plaats vervolgens een microscopiekwaliteit glazen deksel in een 12-well plaat en zaad 0,2 miljoen cellen in één milliliter complete DMEM per put.
De volgende dag bereid je een tienvoudige seriële verdunning voor van anti-ORF2 en konijnenimmunoglobuline G-antilichamen in serumvrije media, met een startantistofconcentratie van 25 microgram per milliliter, en tot een uiteindelijke verdunning van 10 tot de macht van min vijf. Het uiteindelijke volume van de verdunning moet 100 microliter zijn. Voeg vervolgens 1,8 keer 10 toe aan de kracht van vier genoomkopieën van gezuiverde g1-HEV aan elke antistofverdunning.
Incubeer het antistofvirusmengsel bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende een uur. Was de cellen met 500 microliter DPBS. Voeg het antistofvirusmengsel toe aan de cellen.
Incubeer bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende een uur. Was de cellen met 500 microliter buffer. Na toevoeging van DMEM met 2% FBS, incubeer je 72 uur bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.
Verwerk de cellen voor immunofluorescerende kleuring zoals eerder aangetoond. Na het verkrijgen van de fluorescentiebeelden, open je de ImageJ-software. Selecteer Bestand en open de afbeelding.
Selecteer vervolgens Afbeelding, Type en klik op 8-bit om de RGB-afbeelding naar 8-bit formaat te converteren. Stel de drempel aan door Afbeelding te selecteren en vervolgens Aanpassen te kiezen, daarna Drempel, waarbij je het onderste niveau op 40 en het bovenste niveau op 255 zet. Selecteer Analyseren, kies Deeltjes analyseren en schakel resultaten weergeven, Resultaten wissen uit, Samenvatten, Uitsluiten op randen en Composiet interessegebieden in.
Klik vervolgens op OK om fluorescerende vlekkentellingen te krijgen. Bereken procentuele neutralisatie en NT50 als antilog van Log10 NT50, met behulp van de gegeven formule. Plot de grafiek die het gemiddelde en de standaarddeviatie van alle velden toont.
Er werd een significant niveau van g1-HEV ribonucleïnezuur aangetroffen in geïnfecteerde cellen vergeleken met nep-geïnfecteerde cellen. Immunofluorescentietest met anti-ORF2-antilichaam bevestigde ORF2-expressie in de geïnfecteerde HuH-7-cellen. De 50% neutralisatietiter van het anti-ORF2-antilichaam werd geschat op 2,1 keer 10 in de macht van drie.
Representatieve beelden tonen het uiterlijk van nep-geïnfecteerde en G1-HEV-geïnfecteerde HuH-7-cellen in de fluorescentiereductie-neutralisatietest. Dit protocol stelt onderzoekers in staat het neutralisatiepotentieel van anti-HEV-antilichamen te bestuderen en hun 50%-neutralisatietiter te meten. De cruciale stap van dit protocol is het isoleren van het infectieuze hepatitis E-virus en het correct kleuren van cellen en het verkrijgen van beelden met hoge resolutie.
Alternatieve methoden zoals RT-qPCR en ELISA kunnen worden gebruikt om neutralisatietiter te bepalen, maar ze hebben enkele beperkingen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een fluorescentie-reductieneuutralisatietest (FRNT), ontworpen om het neutralisatiepotentieel van antilichamen tegen het Hepatitis E-virus (HEV) te meten. De methode biedt een waardevol alternatief voor plaque-reductieneuutralisatietests (PRNT), die niet haalbaar zijn voor niet-cytopathische virussen zoals HEV. De FRNT stelt onderzoekers in staat om de 50% neutralisatietiter (NT50) van anti-HEV-antilichamen te schatten, wat de ontwikkeling van vaccins en therapeutische antilichamen ondersteunt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Virologie
- Immunologie
- Vaccinontwikkeling
Achtergrond
- Virusneutralisatiewetenschappen beoordelen de werkzaamheid van antilichamen of vaccins tegen specifieke virussen.
- PRNT wordt veelvuldig gebruikt, maar is ongeschikt voor niet-cytopathische virussen zoals HEV.
- HEV is een belangrijke oorzaak van acute virale hepatitis en er is een gebrek aan wijdverbreide beschikbaarheid van vaccins of therapeutische antilichamen.
- Betrouwbare neutralisatieassays zijn nodig om HEV-vaccinkandidaten en antilichaamresponsen te evalueren.
Doel van de studie
- Om een fluorescentiegebaseerde neutralisatieassay voor HEV te ontwikkelen en te beschrijven.
- Om een methode te bieden voor het schatten van de NT50 van anti-HEV-antilichamen.
- Om de evaluatie van vaccinkandidaten en de effectiviteit van antilichamen tegen HEV te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- HEV werd geneutraliseerd met anti-HEV ORF2-antilichamen of konijnen-IgG.
- Het geneutraliseerde virus werd gebruikt om Huh7-cellen te infecteren.
- Immunofluorescentiekleuring was gericht op het virale ORF2-eiwit.
- Fluorescente positieve cellen werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software.
- NT50-waarden werden berekend op basis van de reductie van de fluorescentie.
Belangrijkste resultaten
- De FRNT schatte de NT50 van anti-HEV-antilichamen succesvol in.
- De NT50 werd vastgesteld op 2,1 x 103 voor de geteste antilichamen.
- De methode is toepasbaar op sera van geïmmuniseerde muizen, personen die hersteld zijn van HEV en in het laboratorium geproduceerde antilichamen.
Conclusies
- De FRNT biedt een praktische en effectieve assay voor het meten van HEV-neutraliserende antilichamen.
- Deze methode ondersteunt de evaluatie van vaccinkandidaten en antilichaamgebaseerde therapieën voor HEV.
- Het pakt de beperkingen van de PRNT voor niet-cytopathogene virussen aan.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De kwantitatieve meting van neutraliserende antilichaamtiters tegen het Hepatitis E-virus (HEV) is essentieel voor de evaluatie van vaccinkandidaten en de ontwikkeling van therapeutische antilichamen, vooral gezien het gebrek aan cytopathisch effect in standaard celculturen. De fluorescence reduction neutralization test (FRNT) maakt een robuuste beoordeling van de effectiviteit van antilichamen mogelijk wanneer traditionele plaque-assays niet haalbaar zijn, wat een directe impact heeft op vroege discovery- en translationele onderzoekspijplijnen. Deze mogelijkheid ondersteunt portfoliobeslissingen door bruikbare gegevens te verschaffen over de immunogeniciteit en het neutralisatiepotentieel van HEV-interventies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe kwantificering van antilichaam-gemedieerde HEV-neutralisatie mogelijk voor doelwitvalidatie.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door functionele antilichaam-virusinteracties te bevestigen.
- Biedt voorspellend vertrouwen voor het verder ontwikkelen van vaccin- en antilichaamkandidaten.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare assay voor het meten van neutraliserende titers in niet-cytopathische virussystemen.
- Faciliteert kwantitatieve vergelijking van kandidaat-antilichamen en sera van geïmmuniseerde of herstelde subjecten.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screenings- en optimalisatieworkflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt neutralisatiedata af met translationele biomarkerstrategieën voor HEV.
- Maakt continuïteit mogelijk van antilichaamscreening in de ontdekkingsfase tot preklinische evaluatie van de effectiviteit.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang van vaccin- en therapeutische antilichaamprogramma's.
Integratie van Pipeline & Workflow
De FRNT-methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door een kwantitatieve, reproduceerbare read-out te bieden van antilichaamneutralisatie voor HEV, waarmee de brug wordt geslagen tussen vroege selectie van kandidaten en translationele validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en biologische risicoreductie door de neutralisatiecapaciteit te kwantificeren.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid voor het evalueren van meerdere antilichaam- of serummonsters.
- Analytiek: Levert kwantitatieve NT50-metingen om de neutraliserende potentie onder verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro neutralisatie aan preklinische biomarkerstrategieën voor HEV.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor neutralisatietesten in onderzoek naar niet-cytopathische virussen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de evaluatie van HEV-antilichamen.
- Operationele waarde: Standaardiseert neutralisatietesten voor niet-cytopathische virussen, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid worden verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt gefundeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte ontwikkeling van HEV-vaccins en antilichaam-assets mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten op basis van kwantitatieve neutralisatiedata.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Toegang tot Huh7-celculturen, reagentia voor immunokleuring en fluorescentiemicroscopie is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de opzet van de assay en de interpretatie van gegevens.
- Aanpassing aan andere niet-cytopathogene virussen kan protocoloptimalisatie vereisen.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van gevalideerde anti-HEV-antilichamen en referumsera.
