Hepatitis E Virus Fluorescentiereductie Neutralisatietest voor het meten van neutraliserende antilichaamtiters

Het hoofddoel van de fluorescentiereductie-gebaseerde neutralisatietest is het kwantificeren van het neutralisatiepotentieel van een vaccinkandidaat en antilichamen tegen HEV. De bekende cytopathische aard van HEV beperkt PRND-assay. Dit protocol richt zich op immuno-gebaseerde training van PRND om geïnfecteerde cellen te visualiseren en later te minen - Om te beginnen, tel de vers gesplitste HuH-7-cellen.

Plaats vervolgens een microscopie-kwaliteit glazen deksel in een plaat met 12 putten en zaad 0,2 miljoen cellen per put in één milliliter volledige DMEM aangevuld met 10% FBS. Incubeer de cellen een nacht op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Voeg de volgende dag 500 microliter serumvrije media met 1,8 keer 10 toe aan de kracht van vier genoomkopieën van gezuiverde g1-HEV aan de zaadcellen.

Incubeer bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende een uur. Gebruik 500 microliter DPBS om de cellen drie keer te wassen. Voeg twee milliliter DMEM toe, aangevuld met 2% FBS, aan de putten.

Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 72 uur. Was de cellen drie keer met 500 microliter DPBS en incubeer vijf minuten op kamertemperatuur tussen elke wasbeurt. Voeg 500 microliter 4% paraformaldehyde toe aan de cellen en laat ze 20 minuten op kamertemperatuur incuberen.

Daarna was je de cellen met DPBS zoals eerder gedemonstreerd. Na de laatste wasbeurt incubeer je ze 30 minuten in DPBS op kamertemperatuur. Voeg 250 microliter blokkende oplossing toe met 5% normaal geitenserum, 0,5% runderserumalbumine en 0,3% Triton X100 in DPBS.

Incubeer een uur in een shaker op kamertemperatuur. Verwijder de blokkeringsoplossing en was één keer met 500 microliter DPBS. Voeg vervolgens 250 microliter primaire antistofoplossing toe bij een verdunning van één tot 500.

Breng de cellen een nacht uit op vier graden Celsius. De volgende dag was je de cellen drie keer met DPBS zoals eerder gedemonstreerd. Voeg 100 microliter secundair antilichaam toe bij één-op-1.000 verdunning en incubeer één uur bij kamertemperatuur in een humified kamer.

Voer de wasincubatiecyclus uit zoals eerder gedemonstreerd. Voeg 10 microliter antifade-reagens met DAPI toe aan een glazen glaasje. Bevestig de deksel met cellen die naar het reagens wijzen en vermijd luchtbellen.

Sluit het deksel af met nagellak om het te behouden voor confocale microscopievisualisatie. Tel vers gesplitste HuH-7 cellen. Plaats vervolgens een microscopiekwaliteit glazen deksel in een 12-well plaat en zaad 0,2 miljoen cellen in één milliliter complete DMEM per put.

De volgende dag bereid je een tienvoudige seriële verdunning voor van anti-ORF2 en konijnenimmunoglobuline G-antilichamen in serumvrije media, met een startantistofconcentratie van 25 microgram per milliliter, en tot een uiteindelijke verdunning van 10 tot de macht van min vijf. Het uiteindelijke volume van de verdunning moet 100 microliter zijn. Voeg vervolgens 1,8 keer 10 toe aan de kracht van vier genoomkopieën van gezuiverde g1-HEV aan elke antistofverdunning.

Incubeer het antistofvirusmengsel bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende een uur. Was de cellen met 500 microliter DPBS. Voeg het antistofvirusmengsel toe aan de cellen.

Incubeer bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende een uur. Was de cellen met 500 microliter buffer. Na toevoeging van DMEM met 2% FBS, incubeer je 72 uur bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.

Verwerk de cellen voor immunofluorescerende kleuring zoals eerder aangetoond. Na het verkrijgen van de fluorescentiebeelden, open je de ImageJ-software. Selecteer Bestand en open de afbeelding.

Selecteer vervolgens Afbeelding, Type en klik op 8-bit om de RGB-afbeelding naar 8-bit formaat te converteren. Stel de drempel aan door Afbeelding te selecteren en vervolgens Aanpassen te kiezen, daarna Drempel, waarbij je het onderste niveau op 40 en het bovenste niveau op 255 zet. Selecteer Analyseren, kies Deeltjes analyseren en schakel resultaten weergeven, Resultaten wissen uit, Samenvatten, Uitsluiten op randen en Composiet interessegebieden in.

Klik vervolgens op OK om fluorescerende vlekkentellingen te krijgen. Bereken procentuele neutralisatie en NT50 als antilog van Log10 NT50, met behulp van de gegeven formule. Plot de grafiek die het gemiddelde en de standaarddeviatie van alle velden toont.

Er werd een significant niveau van g1-HEV ribonucleïnezuur aangetroffen in geïnfecteerde cellen vergeleken met nep-geïnfecteerde cellen. Immunofluorescentietest met anti-ORF2-antilichaam bevestigde ORF2-expressie in de geïnfecteerde HuH-7-cellen. De 50% neutralisatietiter van het anti-ORF2-antilichaam werd geschat op 2,1 keer 10 in de macht van drie.

Representatieve beelden tonen het uiterlijk van nep-geïnfecteerde en G1-HEV-geïnfecteerde HuH-7-cellen in de fluorescentiereductie-neutralisatietest. Dit protocol stelt onderzoekers in staat het neutralisatiepotentieel van anti-HEV-antilichamen te bestuderen en hun 50%-neutralisatietiter te meten. De cruciale stap van dit protocol is het isoleren van het infectieuze hepatitis E-virus en het correct kleuren van cellen en het verkrijgen van beelden met hoge resolutie.

Alternatieve methoden zoals RT-qPCR en ELISA kunnen worden gebruikt om neutralisatietiter te bepalen, maar ze hebben enkele beperkingen.