Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Ons onderzoek onderzoekt de ontwikkelingsfunctionarissen van septaat-junctioneiwitten, met de nadruk op het identificeren en karakteriseren van nieuwe componenten die betrokken zijn bij de structuur en biologische rollen. Dit protocol is bedoeld om de organisatie en occluerende functie van geplooide septaatverbindingen in het ectodermale epitel van Drosophila-embryo's te karakteriseren. Om te beginnen kruis gezonde mannelijke en vrouwelijke Drosophila-vliegen met de juiste genotypen en plaats je ze in embryo-verzamelkooien met verse appelsapplaten besmeerd met gistpasta.

Laat de volwassen dieren bevruchte eieren leggen op de appelsapborden. Haal de plaat uit de eicelkooi en laat de embryo's na het leggen van het eier 13 tot 16 uur oud worden bij 25 graden Celsius tot stadium 16. Daarna fixeer je de stadium 16-embryo's in een geschikte fixatieve oplossing en voer immunokleuring uit met de gewenste antistoffen.

Voor het beste resultaat kunt u de embryo's fotograferen met een confocale microscoop met een 40x olie-onderdompelingsobjectief. Na het focussen op het embryo van interesse, stel je de laserintensiteit en versterking in om een sterk fluorescerend signaal te bereiken zonder pixels te oververzadigen. Identificeer stadium 16-embryo's die geen balancer-gecodeerd groen fluorescerende eiwit uiten, met behulp van middarmmorfologie.

Richt de scan op de speekselklier of achterdarm en plaats de Z-scan zo dat de grootste mogelijke diameter van het lumen wordt opgenomen om het volledige laterale membraan van de epitheelcel te visualiseren. Stel een geschikt lijngemiddelde in en beeld een gepolariseerd weefsel in minstens 20 controle- en 20 Cora 4 mutant stadium 16 embryo's. Registreer gegevens alleen van embryo's waarin de adherentie-junctionmarker nauw gelokaliseerd is in het apicaal-laterale gebied van het membraan.

Bij embryo's van wildtype stadium 16 wordt de verrijking van geplooide septaat-junction-eiwitten langs het apicale gebied van het laterale membraan nabij de adherens-verbinding beoordeeld. Noteer de persistente verspreiding van de geplooide septaat junctionmarker langs het laterale membraan in de mutant. Maak een verse kleurstofoplossing door rhodamine-gelabelde 10 kilodalton dextran op te lossen tot 1 milligram per milliliter in 0,5 molair natriumfosfaat bij pH 7,5, met 5 millimolaire kaliumchloride.

Met een naaldtrekker trek je een capillairbuis met vezel van 1 millimeter buitendiameter en 0,5 millimeter binnendiameter in een glazen naald. Vervolgens laad je de glazen naald in de naaldhouder op een micromanipulator en plaats je de micromanipulator naast een omgekeerde microscoop. Oriënteer de naald zo dicht mogelijk parallel aan de glaasglaas, en laat hem zakken naar hetzelfde Z-vlak als de zijkant van de glaas.

Breek de punt van de naald door deze tegen de zijkant van de microscoopglaasje te slaan. Hef de naald boven het niveau van de slede en haal hem eruit voor het laden. Vul vervolgens de capillaire buis met kleurstof met de kleinst beschikbare pipetpunt.

Laad de gevulde naald opnieuw in de naaldhouder. Test de stroming van de 10 kilodalton dextran door een kleine hoeveelheid te injecteren in een druppel halocarbonolie op het oppervlak van een microscoopobjectglas. Met een dekplaat van 22 x 22 mm dikte 2 dikte maak je een ingedrukte lijn op een appelsapbord.

Zet ongeveer 25 embryo's van elk controle en Cora 4 mutant op stadium 16 of 17 op de appelsapplaat. Zorg ervoor dat hun achterste uiteinden langs de lijn liggen en dat de buikzijden naar boven wijzen. Breng vervolgens een stuk dubbelzijdig tape aan op een 22 x 22 millimeter dekmantel van nummer 2.

Raak de tape aan de embryolijn en wrijf zachtjes over het deksel om de embryo's van de plaat op de dubbelzijdige tape te brengen. Voeg vervolgens een druppel halocarbonolie toe aan een microscoopglaasje en bevestig de deksel aan de glaasje door capillaire werking te laten creëren om een binding te creëren. Oriënteer de afdekking dichter bij de zijkant van de glijbaan tegenover een matte deel.

Droog de embryo's drie tot vijf minuten uit in een container droogmiddel en bedek de embryo's volledig met halocarbonolie. Bevestig de sleet met embryo's op de omgekeerde microscoop met de embryo's naar boven en weg van het objectief. Lijn de micromanipulator zo uit dat de naald naar het achterste uiteinde van de embryo's wijst in een hoek zo parallel mogelijk aan de embryo's, en stel de Z-as van de micromanipulator zo aan dat de naaldpunt uitgelijnd is met het midden van het embryo langs de dorsale-ventrale as.

Vervolgens injecteer je de embryo's door de fase snel in de naald te bewegen zodat de naaldpunt het hemocoel binnenkomt. Injecteer ongeveer 0,2 tot 0,5 nanoliter kleurstof met een spuit van 10-25 of 50 milliliter. Haal de naald snel terug en verplaats de fase naar het volgende embryo voor kleurstofinjectie.

Voeg vervolgens extra halocarbonolie over de embryo's toe. Bedek de embryo's met een 22 x 22 millimeter deklaag nummer 2 om een uniforme olielaag tussen de afdekkingen te creëren en verplettering te voorkomen. Voer beeldvorming uit met een fluorescerende microscoop of een confocale microscoop na de injectie van een dextron-kleurstof.

Met de confocale microscoop wordt een Z-stack vernomen door ongeveer een kwart van de embryodiepte langs de dorsale-ventrale as om het lumen van de luchtpijp te beoordelen. Onderzoek het lumen van de luchtpijp, een speekselklier of achterdarm op ophoping van gelabelde dextran. Noteer het genotype en de ontwikkelingsfase van elk embryo en of gelabelde dextran zich ophoopt in een buisorgaan.

Let op embryo's waarin de perivitelline ruimte sterk is gekleurd met kleurstof, omdat dit een onbedoelde injectie in die ruimte kan betekenen. Bij wildtype-embryo's was macroglobulinecomplement-gerelateerd, of Mcr, uniform gelokaliseerd langs het laterale membraan in stadium 13, werd het verrijkt in het apicale gebied van het laterale membraan in stadium 14, en was sterk gelokaliseerd in het apicale-laterale gebied, net basaal van de adherens-verbinding in stadium 16. Corticale antilichaamkleuring definieerde de rijpe geplooide septaatverbindingen in stadium 16 wildtype-embryo's, vergelijkbaar met Mcr.

Bij Cora 4 mutante embryo's bereikte Mcr geen sterke apicale lokalisatie in stadium 16 en bleef het verspreid langs het laterale membraan. E-cadherine lokalisatie was vergelijkbaar bij embryo's van het wildtype en Cora 4 mutant stadium 16. In wildtype stadium 17 embryo's geïnjecteerd met rhodamine-gelabelde 10 kilodalton dextran, omringde de kleurstof de luchtpijp maar drong niet door in het lumen.

Bij Cora 4 mutant stadium 17 embryo's hoopte de kleurstof zich binnen 10 minuten na injectie op in het lumen van de luchtpijp. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om met vertrouwen te bepalen of een gen codeert voor de kern of het accessoirecomponent van de geplooide septaatverbindingen in het embryonale weefsel van Drosophila. Embryo-staging is absoluut cruciaal bij het uitvoeren van deze techniek, omdat dit embryo's in stadium 16 vereist.

De septaat verbindingen rijpen in de loop van de tijd totdat ze volledig gevestigd zijn in stadium 16. Wij geloven dat dit protocol effectief kan worden toegepast in open genetische screening met behulp van RNA-interferentielijnen om nieuwe geplooide septaat-junctiongenen te identificeren.