Name: Mammosfeertest onthult Api5-geïnduceerde stamheid in niet-tumorogene borstepitheelcellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Ontdek hoe de mammosfeertest stamheidseigenschappen in niet-tumorogene borstepitheelcellen evalueert via Api5-overexpressie in MCF-10A-cellen. Deze methode meet zelfvernieuwingscapaciteit en stamcelmarkers voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Coating van weefselkweekplaten met Poly(2 -hydroxyethylmethacrylaat), pHEMA
<ol>
	<li>Los 1,2 g pHEMA (molecuulgewicht ̴ 300.000) op in 100 mL 95% ethanol door constant te roeren op 65 °C om een 1,2% pHEMA-oplossing te bereiden (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Bedek standaard weefselkweekplaten met pHEMA door 1 mL per put van een 6-put plaat toe te passen. Het volume van de pHEMA-oplossing kan worden aangepast op basis van de grootte van het weefselkweekvat.</li>
	<li>Laat de borden onder steriele omstandigheden in een oven drogen op 40 °C.</li>
	<li>Blootstel de platen 15 minuten aan UV-licht, gevolgd door drie washes met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), voordat je ze gebruikt om de mammosfeervormingsassay op te zetten.</li>
</ol>
2. Het zaaien van mammosferen van de primaire generatie
<ol>
	<li>Cultuur 3D-gedissocieerde MCF10A-cellen (controle- en Api5-overexpressie) verkregen door de 16e 3D-culturen van dag 16 in het groeimediumte dissocieren. OPMERKING: Samenstelling van groeimedium: Hoge glucose DMEM zonder natriumpyruvaat aangevuld met 5% paardenserum, 10 μg/mL insuline, 0,5 μg/mL hydrocortison, 20 ng/mL recombinant humaan epidermale groeifactor (EGF), 100 ng/mL choleratoxine en 200 eenheden/mL penicilline-streptomycine (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Verwijder het gebruikte medium, was de cellen met 1 ml DPBS, voeg dan 500 μL 0,05% trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator gedurende 12-15 minuten totdat alle cellen trypsiniseerd zijn. </li>
	<li>Nadat alle cellen zijn losgeraakt, voeg je 2 mL resuspendiemedium toe om de trypsineactiviteit te neutraliseren en draai je de celsuspensie op 112 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Samenstelling van het re-suspension medium: DMEM met een hoog glucosegehalte zonder natriumpyruvaat aangevuld met 20% paardenserum en 200 eenheden/mL penicilline-streptomycine.</li>
	<li>Aspireer het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 1 ml mammosfeermedium. Haal de celsuspensie door een 25 G-naald om een single-cell suspension te krijgen. OPMERKING: Samenstelling van mammosfeermedium: DMEM/F12 aangevuld met 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 1 × B27-supplement zonder vitamine A, en 200 eenheden/mL penicilline-streptomycine (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Met een hemocytometer telt je het aantal cellen en bereken je het volume celsuspensie dat nodig is om 0,2 × 10cellen per put te zaaien. OPMERKING: Houd een lage zaaidichtheid om de efficiëntie van de vorming van de mammosfeer nauwkeurig te bepalen, zodat de impact van celaggregering wordt geminimaliseerd. Bij het verzamelen van eiwitlysaten voor immunoblotting kan de celdichtheid worden verhoogd tot wel 2,5 × 105 cellen per put.</li>
	<li>Verdun het benodigde celsuspensievolume in 2 mL mammosfeermedium en zaad in elke put van een 6-put plaat. Zaadcellen in drievoud voor elke aandoening.</li>
	<li>Incubeer 7 dagen bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-broedmachine.</li>
	<li>Na zeven dagen in kweek tel je handmatig het aantal mammosferen met een diameter groter dan 50 μm in elke put door een microscoop met een graticule te gebruiken of een kwadrantrooster onder een lichtmicroscoop.</li>
	<li>Maak beeld van de mammosferen met een digitale camera die is gemonteerd op een lichtmicroscoop met 20x vergroting.</li>
	<li>Bereken de formatie-efficiëntie van de mammosfeer (MFE) met de volgende formule5 
	 <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. Het zaaien van mammosferen van de secundaire generatie
<ol>
	<li>Verzamel de mammosferen die in de eerste generatie zijn gevormd in een buis van 15 mL en centrifugeer op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Aspireer het supernatant en laat de mammosfeerpellet achter.</li>
	<li>Was de pellet met DPBS.</li>
	<li>Voeg 200 μL 0,05% trypsine-EDTA toe aan de mammosphere-pellet en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator gedurende 2-3 minuten. Haal de mammosferen in de trypsine-oplossing drie keer door een naald van 25 G om een single-cell suspension te verkrijgen.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL resuspensionmedium toe om de trypsineactiviteit te neutraliseren en laat de celsuspensie 10 minuten bij kamertemperatuur draaien op 112 × g .</li>
	<li>Aspireer het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 0,5 mL mammosfeermedium.</li>
	<li>Met een hemocytometer telt u het aantal cellen en berekent het volume celsuspensie dat nodig is om 0,2 × 104 cellen per put te zaaien. OPMERKING: Houd een lage celdichtheid om het zelfvernieuwingsvermogen te beoordelen, waardoor het effect van celaggregatie wordt geminimaliseerd.</li>
	<li>Verdun het benodigde celsuspensievolume in 2 mL mammosfeermedium en zaad in elke put van een 6-put plaat. Zaadcellen in drievoud voor elke aandoening.</li>
	<li>Incubeer 7 dagen bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-broedmachine.</li>
	<li>Na 7 dagen in kweek telt je het aantal mammosferen met een diameter groter dan 50 μm in elke plaat met een microscoop uitgerust met een graticule of een kwadrantrooster.</li>
	<li>Maak beeld van de mammosferen met een digitale camera die is gemonteerd op een lichtmicroscoop met 20x vergroting.</li>
	<li>Bereken de zelfvernieuwingscapaciteit met de volgende formule5 
	<img alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Western blotting om veranderingen in pluripotentiemarkers bij Api5-overexpressie te detecteren
<ol>
	<li>Verzamel de mammosferen die in de eerste generatie zijn gevormd in een buis van 15 mL en centrifugeer op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Aspireer het supernatant en laat de mammosfeerpellet achter.</li>
	<li>Was de pellet met DPBS.</li>
	<li>Verzamel de pellet in een ijskoude RIPA-buffer om het eiwitlysaat te verkrijgen en voer immunoblotting uit volgens standaardprotocol24. OPMERKING: Samenstelling van de RIPA-buffer: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS), 1 mM ethyleendiaminetetraasynzuur (EDTA), 1 mM fenylmethysulfonylfluoride (PMSF), 10 mM natriumfluoride, 1 mM natriumorthovanadat.</li>
	<li>Probe op stamheidsmarkers - Okt3/4, Nanog, Sox2 en Bmi1, en belastingcontrole GAPDH (zie Materiaaltabel voor antilichaamverdunningen).</li>
	<li>Kwantificeer eiwitniveaus met behulp van densitometrische analyse op ImageJ. Selecteer het regio van interesse op Western blot-afbeeldingen en genereer een dichtheidsprofiel voor elke baan.</li>
	<li>Normaliseer de relatieve dichtheden van het eiwit van belang ten opzichte van die van GAPDH voor elke baan. Bereken de vouwverandering voor elk eiwit.</li>
	<li>Plot de vouwverandering in eiwitniveaus met een willekeurige plotsoftware.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C bevochtigde incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Konijn pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 verdunning, overnachtelijke incubatie bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH-antilichaam</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 verdunning, 1 uur incubatie bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Konijn mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 verdunning, overnachtelijke incubatie bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4-antilichaam (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 verdunning, overnachtelijke incubatie bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Sox2-antilichaam (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 verdunning, overnachtelijke incubatie bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamine A</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxine&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;1 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermale groeifactor (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>100 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>Hoge glucose DMEM zonder natriumpyrovaat</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Paardenserum&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Wordt gebruikt om pH van Tris-HCl (pH 8,0) aan te passen</td></tr><tr><td>Hydrocortison&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>1 mg/mL stock in ethanol</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Beeldverwerkingssoftware</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western chemiluminiscent HRP substraat</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>10 mg/mL stock in 1% ijzersterk azijnzuur</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 microscoop</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A-cellen</td><td></td><td></td><td>Cadeau van Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, VS)</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plottingsoftware&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylaat) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>1,2% pHEMA in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdeoxycholaat</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluoride (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffer</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

mammosfeertest onthult api5-geïnduceerde stamheid in niet-tumorogene borstepitheelcellijnen

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

Om de efficiëntie van mammosfeervorming onder niet-hechtende omstandigheden te beoordelen, werden controle- en Api5-overexpressieve 3D-gedissocieerde MCF10A-cellen op polyHEMA-gecoate platen volgens het protocol geplaatst. Api5-overexpressieve cellen toonden een 1,58-voudige toename in de gemiddelde efficiëntie van de vorming van de mammosfeer ten opzichte van de controles (Figuur 1B,C). Deze toename toont aan dat een hogere expressie van Api5 het aandeel stamcelachtige voor...

Mammosfeertest onthult Api5-geïnduceerde stamheid in niet-tumorogene borstepitheelcellijnen

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

mammosphere-assay-reveals-api5-induced-stemness-non-tumorigenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Deze video beschrijft het isoleren van kankerstamcellen van borstkankercellijnen. We kweeken deze kankerstamcellen om primaire mammosfeer te genereren voor het beoordelen van zelfvernieuwing en het berekenen van sfeervormende efficiëntie, waardoor vergelijking tussen verschillende zaaidichtheden mogelijk is.

Generatie van primaire mammosfeer: een techniek om celpotentie te bepalen

Werkwijze voor menselijke mammaire chirurgische discard materiaal wordt beschreven. Verwerkte weefsel in de vorm van organoids, onbeperkt worden opgeslagen bevroren of in kweek zijn geplaatst voor lange termijn. Deze methode maakt experimentele onderzoek van normale menselijke epitheliale celbiologie en de effecten van exogene verstoringen.

Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

In vitro bollen-assays worden vaak gebruikt om kanker stamcellen te identificeren. Hier vergelijken we enkele met meercellen gebaseerde bollen-assays. De meer bewerkelijk enkele cel-gebaseerde assays of methylcellulose suppletie geven nauwkeurigere resultaten terwijl meercellen gebaseerde assays uitgevoerd in vloeibaar medium sterk kunnen worden beïnvloed door celdichtheid.

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Drijvende mammosfeer-assays kunnen de subset van stamcel-achtige borstkankercellen onderzoeken die overleven in suspensie-omstandigheden en verhoogde tumorigenese vertonen wanneer ze in muizen worden geïmplanteerd. Dit protocol biedt een handige in vitro maatstaf voor sfeervormingsvermogen, een proxy voor in vivo tumorigenese, terwijl het de analyse van het stamcel-geassocieerde transcriptionele landschap vergemakkelijkt.

Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

Het doel van deze methodologie is om kankercellen (CSC) te identificeren in kankercellijnen en primaire menselijke tumormonsters met het bolvormende protocol, op een robuuste manier, met behulp van functionele testen en fenotypische karakterisering met stroomcytometrie en westerse Vlek.

Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren

Hier beschrijven we de uitvoering en interpretatie van de resultaten van een in vitro mammosphere zelf vernieuwing kwantitatieve assay.

Kwantificering van zelf vernieuwing in Muriene Mammosphere culturen

Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Dit experimentele protocol beschrijft de isolatie van BCSC's uit borstkankercel- en weefselmonsters, evenals de in vitro en in vivo assays die kunnen worden gebruikt om bcsc-fenotype en -functie te beoordelen.

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Dit protocol beschrijft een schaalbare intraductale CRISPR-screeningsbenadering die parallelle in vivo genknockout- en activatiestudies in de muismelkklier mogelijk maakt.

Parallelle in vivo screening van gen-knockout en activatie in de muismelkklier

Ontdek hoe de mammosfeertest stamheidseigenschappen in niet-tumorogene borstepitheelcellen evalueert via Api5-overexpressie in MCF-10A-cellen. Deze methode meet zelfvernieuwingscapaciteit en stamcelmarkers voor kankeronderzoek.

Mammosfeertest onthult Api5-geïnduceerde stamheid in niet-tumorogene borstepitheelcellijnen

Meer video's verkennen