Fenotypische profilering van door MPTP geïnduceerde Parkinson-achtige gedragsfenotypes bij zebravislarven op basis van gedragsexperiment

We presenteren een multiparametrisch gedragsprotocol om motorische en niet-motorische Parkinsoniaanse fenotypes bij larvale zebravissen volledig te profileren. Dit protocol is van toepassing op modellering van de ziekte van Parkinson, medicijnscreening, milieuneurotoxiciteit en studies met vislarven. Begin met het dragen van passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, een laboratoriumjas en beschermende brillen.

Verdun de 100x E3-bouillonoplossing in een verhouding van één tot 100 met ultrazuiver water om een medium met één sterkte te maken. Selecteer nu geslachtsrijpe mannelijke en vrouwelijke volwassen zebravissen. Gebruik kweektanks met verwijderbare scheidingsdelen om gecontroleerd te fokken.

Om 20:00 uur plaats je mannetjes- en vrouwelijke zebravissen in aparte secties van de broedbakken met een verhouding van twee mannetjes tot drie vrouwtjes, waarbij je scheidingsdelen gebruikt om ze uit elkaar te houden. De volgende ochtend om 8:00 uur verwijder je de scheidingsdelen om paring mogelijk te maken. Verzamel de embryo's een uur later en was ze drie keer met schoon systeemwater.

Bewaar de embryo's in 100 millimeter petrischaaltjes met 20 milliliter verse E3-medium. Daarna broed je de embryo's uit bij 28 graden Celsius onder een lichtcyclus van 14 uur en een cyclus van 10 uur in het donker. Verwijder één dag na de bevruchting voorzichtig onbevruchte, misvormde en abnormale embryo's met een weidepipet.

Aspireer het medium langzaam vanaf de rand van de Petrischaal en voeg vers E3-embryomedium toe langs de wand van de Petrischaal om verstoring van de wilde embryo's te minimaliseren. Voor de MPTP-behandelde groep gebruik je een MPTP-oplossing van 50 micromolair. Vier dagen na bevruchting pas je een drie milliliter weidepipette aan door 10 millimeter van de punt af te snijden om een brede boring te creëren.

Om 18:00 uur gebruik je de aangepaste pipet om zebravislarven uit elke groep te selecteren en plaats je één larve per put in een plaat met 96 putten. Bekijk elke laag onder een stereomicroscoop om te bevestigen dat elke zebravislarve er gezond uitziet. Controleer of de vinnen open zijn en regelmatig zwaaien, dat het lichaam rechtop staat en de zwemladder is opgeblazen.

Maak vervolgens de onderkant van de plaat zorgvuldig schoon om te voorkomen dat vuil de video-tracking beïnvloedt. Vervolgens plaats de 96-well-plaat centraal op de bodem van de zebrabox. Selecteer de kwantisatiemodus in de videotrackingsoftware.

Voor monitoring van slaap-wakkerheidsregulatie stel je de lichtinstelling zo in dat het licht om 22:00 uur uitgaat en om 8:00 uur weer aan gaat. Configureer de softwareparameters zo dat de detectiedrempel wordt ingesteld op 40, burst op 25, freeze op vier, totale monitoringtijd op 52 uur, en vervolgens op 60 seconden. Begin de slaap-wake-procedure om 8:00 uur PM.To monitor de fotomotorische reacties, plaats de larven van vijf dagen na de bevruchting in een plaat met 96 putten en één larve per put. Stel vervolgens het lichtovergangsprogramma in op nul tot 60 seconden duisternis, gevolgd door 60 tot 120 seconden constant licht.

Start het protocol en verzamel bewegingsparameters elke zes seconden gedurende de 120 seconden durende assay. Stop het protocol na 120 seconden en exporteer het databestand. Vervolgens plaats je de larven vijf minuten in volledige duisternis om ze te laten wennen aan de daaropvolgende donkere stroboscooplichttest.

Stel het lichtovergangsprogramma in om stroboscopisch licht te leveren bij 10 hertz gedurende 60 seconden. Om thigmotaxis te beoordelen, kies je twee platen met zes putjes. Vul elke put met vier milliliter E3 medium.

Vijf dagen na bevruchting verzamel zebravislarven uit de wildtypegroep en de MPTP-behandelde groep en plaats ze in aparte zes putplaten. Plaats vóór de thigmotacsi-beoordeling de putplaten 15 minuten in de zebrabak om acclimatie mogelijk te maken. Gebruik vervolgens de draw area-functie om twee concentrische cirkels in elke put te tekenen met de binnenste cirkelradius gelijk aan de helft van de straal van de put, en begin met de beoordeling.

Voor een lokomotorische beoordeling worden zebravislarven van vijf dagen oud uit de wildtypegroep en de door MPTP behandelde groep in twee aparte platen met 12 putten geplaatst. Na een acclimatisatie van 15 minuten selecteer je de online tracking-analysemodus en registreer je de bewegingsactiviteit gedurende vijf minuten met het geautomatiseerde videotrackingsysteem. Voor de startle response-test worden de vijf dagen oude larven individueel overgebracht in twee platen met 12 bronnen met één larve per put en twee milliliter E3-medium.

Plaats de platen in de zebrabox voor een lichte aanpassingsperiode van vijf minuten. Start de ZebraLab-software en activeer de tracking online analysemodus. Open de lichttriggerinterface, selecteer dan, gebruik een van de drie onderstaande triggermethoden en schakel verbeterde stimuli in.

Stel vervolgens de startmethode in op wanneer de sessie begint. Definieer in het overgangsschema het dark flash-ritme. Stel het programma in om na 21 seconden te activeren, en stel vervolgens de overgang één tot vijf milliseconden in met 100% lichtintensiteit.

Overgang van twee naar 2, 890 milliseconden met 100% lichtintensiteit. Schakel drie tot vijf milliseconden over met 0% lichtintensiteit, en vier naar 100 milliseconden met 0% lichtintensiteit. Vink het vakje aan voor herhaalde overgangen om periodiek te flashen, en start dan het protocol.

Voor de lichtdonkere challenge-assay overbrengen zebravislarven naar twee platen met 24 putten met één larve per put en één milliliter E3 medium. Na vijf minuten acclimatie in de zebrabox zet je de online modus voor trackinganalyse aan. Vervolgens configureer je het lichtprogramma op zes minuten constant licht, gevolgd door vier minuten volledige duisternis.

Stop op de 10e minuut met het opnemen van gedrag en sla de data op. Haal het bord voorzichtig uit de zebrabak. Na elk gedragsexperiment spray en veeg je alle met MPTP gecontacteerde oppervlakken met vers bereide natriumhypochlorietoplossing.

Verzamel vloeibaar en vast afval met MPTP en label dit duidelijk als gevaarlijk neurotoxisch afval. Behandel alle besmette materialen met een vers bereide natriumhypochlorietoplossing. Behandelde zebravislarven vertoonden verstoorde sporen van slaap en waakactiviteit vergeleken met de wildtypegroep.

De totale slaaptijd was ook significant verhoogd in de behandelde groep. Het aantal uitslapende sessies was significant verminderd in de behandelde groep, terwijl de gemiddelde slaapduur toenam. De waakactiviteit en gemiddelde activiteit waren significant verminderd in de behandelde groep.

Bij constant licht was de vriesindex van de behandelde groep significant verhoogd. Het nam ook aanzienlijk toe onder stroboscooplichtstimulatie bij 10 hertz. Fotomotorische responscurves toonden een verminderde reactiviteit in de behandelde groep.

Volgresultaten gaven minder beweeg- en exploratiegedrag aan bij de behandelde groep. Het totale zwemmen en de gemiddelde zwemsnelheid waren ook aanzienlijk verminderd in de behandelde groep. De bevriezingstijdverhouding was significant hoger in de behandelde groep, maar de verhouding van snelle bewegingstijd was aanzienlijk lager.

Afwisselende licht- en donkerovergangen veroorzaakten uitgesproken snelheidspieken bij wildtypelarven. De afstand die na stimulatie werd gezwommen en de pieksnelheid na stimulatie waren significant verminderd in de behandelde groep. De latency tot pieksnelheid was ook aanzienlijk vertraagd in de behandelde groep.

De belangrijkste uitdaging is het minimaliseren van interne determinanten terwijl rekening wordt gehouden met individuele variabiliteit om nauwkeurige en reproduceerbare gedragsanalyse op zebravisniveau te waarborgen. Gedragsclustering en fenomische profilering kunnen worden toegepast om subtiele neurotoxische effecten te ontdekken en diepere magnetische inzichten te verkrijgen. Toekomstige studies kunnen dit platform toepassen op hazard-goedgekeurde geneesmiddelscreening en de farmacologische evaluatie in zebravissen Parkinson's Disease-modellen.