Extractie van kortketenvetzuren uit muizenuitwerpselen met behulp van een tweefasige zuur–oplosmiddelmethode
17 juli 2026
Dit protocol beschrijft een tweefasige zuur-oplosmiddelextractiemethode om korteketenvetzuren uit laag-invoer muisuitwerpselmonsters te isoleren zonder derivatisatie.
Dit protocol maakt het mogelijk om korteketenvetzuren of SCFA's uit muisfecale monsters met lage input te extraheren voor routinematige analyse op basis van gaschromatografie. SCFA's zoals acetaat, propionaat en butyraat worden geproduceerd door darmmicrobiota door de fermentatie van voedingsvezels. Ze worden veel bestudeerd omdat ze geassocieerd zijn met gedrags-, metabole en fysiologische fenotypes.
Het kwantificeren van SCFA's in ontlastingsmonsters blijft echter een uitdaging. Deze metabolieten zijn vluchtig, vaak aanwezig in lage concentraties, en worden gemeten in complexe biologische matrices. In muizenstudies is de hoeveelheid ontlasting die van elk dier wordt verzameld vaak ook beperkt.
Standaardmethoden kunnen derivatisatie, relatief grote monstervolumes of gespecialiseerde apparatuur vereisen. Hier wordt een tweefasige workflow voor extractie van zuur oplosmiddelen gepresenteerd met verdund zoutzuur en ethylacetaat voor de extractie van SCFA's uit muizenuitwerpselmonsters met lage input in een formaat dat compatibel is met routinematige GC-analyse. Dus beginnen we met onze juiste lay-out om verder te gaan met de rest van ons protocol.
Daarna hebben we onze monsterdoos met onze bevroren ontlastingsmonsters correct gelabeld. Vervolgens zetten we onze 1000 microliter pipet op 255. Nu hebben we onze gelabelde HCl-verdunning.
We gaan verder met het toewijzen van HCl aan elk van onze monsters. Nu doen we ethanol in onze schoonmaakput voor onze pincet. Nu gebruiken we dezelfde ethanol om ons bad voor onze stampers te maken.
Nu pakken we onze ontlastingsmonsters en doen ze in de centrifugebuisjes. Nu gebruiken we onze schone stampers om elk ontlastingsmonster in hun respectievelijke centrifugebuisjes te malen. We nemen onze monsters en brengen ze minstens 10 seconden aan op de vortex of totdat ze volledig gemengd zijn.
We brengen de gemengde monsters naar onze centrifuge en zetten het op. Zorg voor een goede balans van de centrifuge. Zet de centrifuge op 16.000 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.
Na 10 minuten haal je je monsters uit de centrifuge. Label nieuwe centrifugebuisjes die overeenkomen met je monsters. Stel je 200 microliter pipet in op 120.
Verwijder voorzichtig het supernatant en zorg ervoor dat je de pellet niet aanraakt. Doe het supernatant over in je nieuwe respectievelijke flesjes. Je kunt het pelletje weggooien.
Voeg een gelijke hoeveelheid ethylacetaat toe aan je nieuwe flesjes. Breng deze monsters terug naar de centrifuge. Stel de centrifuge in op 2.374 keer g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.
Na 20 minuten verwijder je je monsters. Label nieuwe centrifugebuisjes die overeenkomen met je monsters. Zet je pipet terug op 120 microliter.
Wees voorzichtig dat je de onderste laag niet aanraakt, verwijder alleen de bovenste laag. Doe het supernatant over in nieuwe flesjes met correct gelabelde buisjes. Breng deze monsters over naar je monsterdoos voor opslag tot verdere analyse.
Plaats tenslotte een monsterdoos in een vriezer bij negatieve 80 graden Celsius. De geëxtraheerde SCFA-aliquoten, elk 120 microliter, werden opgeslagen bij min 80 graden Celsius voordat ze gekwantificeerd werden met gaschromatografie. Kwantitatieve analyse identificeerde acht SCFA's, waaronder de belangrijkste metabolieten: azijnzuur, propionzuur en boterzuur zoals weergegeven in de figuur.
Om SCFA-isolatie te valideren, werden gaschromatografiegegevens beoordeeld via herstel- en reproduceerbaarheidstesten. Het herstel werd geëvalueerd door controlemonsters met bekende concentraties van de interne standaard te spikeren, terwijl reproduceerbaarheid werd bevestigd door herhaalde analyses binnen en over dagen. Samenvattend biedt dit protocol een workflow voor SCFA-extractie uit muisontlastingsmonsters met weinig input.
Het vereist geen derivatisatie en is compatibel met routinematige GC-gebaseerde analyse. Deze methode kan fecale SCFA-meting ondersteunen in diverse muismodellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het extraheren van kortketenige vetzuren (SCFA's) uit fecale muisstalen met een lage input door middel van een tweefasige zuur-oplosmiddelextractiemethode. De aanpak is geoptimaliseerd voor kleine steekproefgroottes en is compatibel met standaard laboratoriumapparatuur, waardoor een efficiënte preparatie van monsters voor analyse via gaschromatografie mogelijk wordt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Analytische chemie
- Metabolomics
- Microbioomonderzoek
Achtergrond
- Korte-keten vetzuren (SCFA's) zijn belangrijke microbiële metabolieten in de darm met significante biologische rollen.
- Nauwkeurige kwantificatie van SCFA's uit kleine fecesmonsters is uitdagend in studies met kleine dieren.
- Bestaande extractiemethoden kunnen derivatisering of grote hoeveelheden monster vereisen.
- Er is behoefte aan gestandaardiseerde, efficiënte protocollen die compatibel zijn met routinematige analytische workflows.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het extraheren van SCFA's uit individuele muisontlasting-monsters van 20–50 mg.
- Het mogelijk maken van fasescheiding zonder derivatisering met behulp van verdund zoutzuur en ethylacetaat.
- Het waarborgen van de compatibiliteit met gaschromatografie-analyse.
Gebruikte methoden
- Homogenisatie van feces
- Verzuring met verdund zoutzuur
- Partitionering met organische oplosmiddelen met behulp van ethylacetaat
- Centrifugatie bij lage temperatuur
- Gebruik van standaard laboratoriumapparatuur
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle extractie van belangrijke SCFA's (acetaat, propionaat, butyraat) uit individuele fecesmonsters van muizen.
- Duidelijke resolutie van SCFA-pieken op karakteristieke retentietijden boven de achtergrondruis.
- Het protocol is effectief voor monsters met een lage input en behoudt de compatibiliteit met routinematige gaschromatografieplatforms.
Conclusies
- Het protocol biedt een gestandaardiseerde workflow voor de extractie van SCFA uit beperkte hoeveelheden fecesmateriaal.
- Het pakt procedurele uitdagingen aan bij studies met kleine dieren.
- De methode ondersteunt betrouwbare downstream SCFA-analyse met gebruik van gangbare laboratoriumapparatuur.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Gestandaardiseerde extractie van kortketenige vetzuren (SCFA's) uit muisontlastingsmonsters met een lage input pakt een kritiek knelpunt aan in microbiome-gestuurde ontdekkingen en preklinische metabolomics. Dit protocol maakt betrouwbare kwantificering van SCFA's mogelijk met behulp van routinematige gaschromatografie, wat translationele studies ondersteunt die darmmicrobiële metabolieten koppelen aan de biologie van de gastheer. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkingen en faciliteert de vergelijkbaarheid tussen studies voor R&D-portfolio's van ondernemingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt robuuste meting van darm-afgeleide SCFA's mogelijk voor hypothese-gestuurd microbiome-onderzoek.
- Ondersteunt functionele validatie van microbiële metabole routes in ziekterelevante modellen.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door het leveren van kwantitatieve metaboliet-readouts.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gestandaardiseerde biologische extracten voor die compatibel zijn met high-throughput gaschromatografie-workflows.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van assays bij preklinische monsters met een lage input.
- Maakt betrouwbare screening mogelijk van interventies die de productie van SCFA moduleren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt de kwantificatie van metabolieten uit met translationele biomarkerstrategieën in kleine-diermodellen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van interventies gericht op het microbioom.
- Vermindert het risico op analytische variabiliteit in onderzoek over verschillende studies en locaties heen.
Integratie van pipeline en workflow
Dit extractieprotocol past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor kwantitatieve SCFA-analyse uit beperkt biologisch materiaal mogelijk wordt en downstream biomarker- en mechanistische studies worden ondersteund.
- Discovery Biology: Biedt een gestandaardiseerde workflow voor hypothesetoetsing en het onderzoeken van signaalpaden in microbiome-onderzoek.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve SCFA-metingen die geschikt zijn voor assay-ontwikkeling en de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert duidelijke chromatografische pieken voor de vergelijkende analyse van experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van preklinische metabolietgegevens met translationele biomarkerdoelstellingen.
- Enterprise Reuse: Biedt een breed toepasbare extractiemethode voor diverse microbiome- en metabolomicsstudies.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in relaties tussen het microbioom en metabolieten en in de validatie van targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert extractie en analyse over verschillende studies, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid worden verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk voor programma's gericht op het microbioom en vermindert analytische risico's in een laat stadium.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van ontdekkingselementen die worden aangestuurd door het microbioom en metabolieten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in monsterhomogenisatie en gaschromatografie-analyse.
- Maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en routinematige analytische infrastructuur.
- Vereist strikte naleving van gestandaardiseerde extractie- en analyseprotocollen door alle teams.
- Aanpasbaar aan diverse kleine diermodellen en beperkte monstermengden.
- De extractie-efficiëntie en detectielimieten moeten worden gevalideerd voor elke experimentele context.
