Functionele beoordeling van de muis-gingivale epitheliale barrière met behulp van fluorescerende tracers
27 februari 2026
Het doel van dit protocol is een gestandaardiseerde benadering te bieden voor het kwantitatief beoordelen van de integriteit van de muisachtige gingivale epitheliale barrière door topisch fluorescentie-gelabelde dextrans van verschillende molecuulgroottes op het gingivale oppervlak in vivo toe te passen, gevolgd door ex vivo beeldvorming met een enkelfotonmicroscopiesysteem.
Dit is een gestandaardiseerd protocol voor het kwantitatief beoordelen van de integriteit van gingivale epitheliale barrières. Dit protocol is nuttig voor het bestuderen van barrièrestoornis en het testen van barrièreherstellende geneesmiddelen in gingiva. Om te beginnen verdeel mannelijke wildtype C57BL/6J-muizen in drie groepen: een onbehandelde controlegroep, een door ligatie geïnduceerde parodontitisgroep en een door Porphyromonas gingivalis geïnduceerde parodontitisgroep.
Selecteer fluorescerende tracers met niet-overlappende spectra, zoals FITC-gelabelde dextran en rhodamine B-gelabelde dextran. Om de tracers te verdunnen, meng je per liter één gram FD40 en RD70 in 2% carboxymethylcellulosegel. Bewaar het bereide mengsel op ijs.
Na het bevestigen van de verdovingsdiepte door een teenknijpreflex, gebruik je een mondprop om de mondholte van de verdoofde muis open te houden. Breng 50 microliter van het voorbereide tracermengsel topisch aan op het labiale tandvleesoppervlak van het molaire gebied. Laat het mengsel 30 minuten zitten en breng het opnieuw aan als het doorgeslikt wordt.
Na 30 minuten tracer-aanbrengen bevestig je de muis op een rugligging op karton en zet je de ledematen vast met tape om het dier te immobiliseren. Open vervolgens de mondholte van de geëuthanaseerde muis en isoleer de maxilla. Maak voorzichtig het omliggende weefsel weg en spoel het monster grondig af met PBS.
Plaats de geïsoleerde maxilla op een glazen sparaat. Breng vervolgens modelleerklei aan beide zijden om de deksel te stabiliseren en over het monster te bevestigen. Plaats de gedissectiede maxilla zorgvuldig op de speciaal ontworpen monsterhouder om een stabiele plaatsing voor beeldvorming te garanderen.
Met een rechtopstaande enkele fotonmicroscoop uitgerust met een 25x wateronderdompelingsobjectief. Focus op het gemonteerde ondersteuningsgebied onder de maxilla en maak beelden. Selecteer het gebied van interesse op het buccale oppervlak van de tweede kies in de maxilla en begin direct met beeldvorming.
Neem Z-stackbeelden met een stapgrootte van één micrometer, beginnend vanaf het gingivale oppervlak tot een diepte van 100 tot 200 micrometer voor driedimensionale reconstructie. Klik in de software op bestand en selecteer nieuwe map om een nieuwe map voor de dataset aan te maken en een beschrijvende naam toe te wijzen. Stel onder het tabblad acquisitie het XY-formaat in op 512 bij 512 met een resolutie van 0,99 micrometer per pixel.
Stel daarna de zoomfactor in op één. Stel vervolgens de excitatiegolflengten in op 488 nanometer en 561 nanometer. Configureer emissievensters respectievelijk op 500 tot 550 nanometer en 570 tot 620 nanometer.
Voor Z-serie en driedimensionale beeldvorming, kies de ND-acquisitiemodus. Stel de Z-stap in op één micrometer en pas het aan indien nodig. Na het configureren van parameters selecteer je live mode om het gingivale gebied in individuele en samengevoegde fluorescentiekanalen te visualiseren.
Klik dan op 'start nu' om beeldacquisitie te starten. Om de permeabiliteit te meten, scheid je de fluorescentieintensiteit van FD40 en RD70 in verschillende kanalen. Voeg de Z-as sneden samen zonder achtergrondaftrekking.
Gebruik vervolgens ImageJ-software om de fluorescentieintensiteit te kwantificeren en zo de permeabiliteit van de epitheliale barrières te beoordelen. Klik op bestand en selecteer open om de maxilla-afbeelding in ImageJ te openen. Druk dan op image en verander het afbeeldingstype naar 8-bits formaat voor analyse.
Klik op analyseren, selecteer set metingen. Controleer dan area, gemiddelde en geïntegreerde dichtheid, en klik op oké om te bevestigen. Selecteer vervolgens het gewenste kanaal en pas de drempel aan door op afbeelding te klikken, op aanpassen te kiezen en drempel te selecteren.
Schakel de optie voor donkere achtergronden in om rekening te houden met zwarte achtergronden. Klik op analyseren en selecteer set metingen. Controleer dan de gemiddelde grijswaarde en limiet tot de drempel, en bevestig door op oké te klikken.
Met behulp van het vrijhandse selectiegereedschap volgt u handmatig de omtrek van het fluorescerende signaalgebied aan de kant van het gingivale weefsel. Klik op analyseren en selecteer maat om fluorescentieintensiteitswaarden te verkrijgen waarbij geïntegreerde dichtheid de fluorescentieintensiteit vertegenwoordigt. Kopieer de meetresultaten naar een spreadsheet voor berekeningen en grafieken.
Bereken de gemiddelde fluorescentieintensiteit van de controlegroep in de spreadsheet. Deel de fluorescentieintensiteitswaarde van elke experimentele groep door het gemiddelde van de controlegroep om de relatieve fluorescentieintensiteit te verkrijgen. In de controlegroep waren beide fluorescerende tracers grotendeels beperkt tot het gingivale oppervlak.
In zowel de ligatie- als de door Porphyromonas gingivalis behandelde groepen werd significante extravasatie van zowel FD40 als RD70 in het gingivale epitheel waargenomen. Semi-kwantitatieve analyse toonde een significant verhoogde fluorescentieintensiteit van zowel FD40 als RD70 aan in de ligatie- en Porphyromonas gingivives-behandelde groepen. 3D-beeldvorming toonde een uitgebreidere en diffusere verspreiding van tracerfluorescentie rond het gingivale bloedvat in de ligatie- en Porphyromonas gingivis-behandelde groepen vergeleken met controles.
Dit protocol kwantificeert de permeabiliteit en integriteit van de paracellulaire barrière van muisen. Dit protocol kan worden gecombineerd met micro-CT voor multimodale beeldanalyse. Verdere studies kunnen barrièrereparatiemiddelen en moleculaire mechanismen bij mondziekten onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De gingivale epitheelbarrière dient als een kritieke eerste verdedigingslinie bij de orale immuniteit en homeostase. Een intacte epitheelbarrière voorkomt effectief de penetratie van schadelijke stoffen uit de orale omgeving, terwijl een verstoring ervan nauw verbonden is met de pathogenese van aandoeningen zoals parodontitis en oraal lichen planus. Hier hebben we een methode gebaseerd op topische applicatie ontwikkeld om de integriteit van de gingivale epitheelbarrière bij muizen te beoordelen. Eerst werd een mengsel van fluorescentielabelled dextranen met verschillende molecuulgewichten (40 of 70 kDa) in 2% natriumcarboxymethylcellulose topisch aangebracht op het labiale gingivale oppervlak van de molaire regio. Na een incubatieperiode van 30 min werd de maxilla gedissecteerd en gefixeerd in een op maat gemaakte houder voor onmiddellijke beeldvorming met behulp van een single-photon microscopiesysteem. Deze aanpak maakt visualisatie en kwantificering van tracers van verschillende grootten over de epitheellagen mogelijk, wat een functionele read-out geeft van de integriteit van de gingivale epitheelbarrière, toepasbaar bij studies naar orale ontsteking, wondgenezing en ziekte modellering.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Orale biologie
- Immunologie
- Epitheliale barrièrefunctie
Achtergrond
- De gingivale epitheliale barrière is een cruciale eerste verdedigingslinie voor de orale immuniteit en homeostase.
- Een intacte epitheliale barrière voorkomt het binnendringen van schadelijke stoffen vanuit de orale omgeving.
- Verstoring van de gingivale epitheliale barrière is geassocieerd met parodontitis en oraal lichen planus.
- Functionele beoordeling van de integriteit van de barrière is essentieel voor het bestuderen van orale inflammatie, wondgenezing en ziektemodellering.
Doel van de studie
- Om een methode op basis van topische applicatie vast te stellen voor het beoordelen van de integriteit van de gingivale epitheliale barrière bij muizen.
- Om visualisatie en kwantificering van tracers met verschillende moleculaire gewichten over epitheliale lagen mogelijk te maken.
- Om een functionele read-out van de barrière-integriteit te bieden die toepasbaar is op modellen van orale ziekten.
Gebruikte methoden
- Topische applicatie van fluorescent gelabelde dextranen (40 of 70 kDa) in 2% natriumcarboxymethylcellulose op het labiale gingivale oppervlak.
- Incubatieperiode van 30 minuten om penetratie van de tracer mogelijk te maken.
- Dissectie en fixatie van de maxilla in een op maat gemaakte houder.
- Beeldvorming met behulp van een single-photon microscopiesysteem.
- Kwantificering van de tracerpenetratie door de epitheellaag om de integriteit van de barrière te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt visualisatie en kwantificering mogelijk van fluorescerende dextranen van verschillende groottes over de gingivale epitheellaag.
- De penetratie van de tracer biedt een functionele read-out van de integriteit van de gingivale epitheliale barrière.
- De benadering is toepasbaar op studies naar orale ontsteking, wondgenezing en ziektemodellering.
- Verstoring van de barrière kan worden gedetecteerd door een toegenomen penetratie van de tracer.
Conclusies
- De topicaal toegepaste methode met fluorescerende dextranen maakt een functionele beoordeling van de integriteit van de gingivale epitheliale barrière bij muizen mogelijk.
- Deze aanpak biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van orale immuniteit, barrièredysfunctie en gerelateerde pathologieën.
- De methode is geschikt voor toepassingen bij orale inflammatie, wondgenezing en ziektemodellering.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De gingivale epitheelbarrière dient als een cruciale eerste verdedigingslinie in de orale immuniteit, en de verstoring hiervan is gekoppeld aan inflammatoire orale aandoeningen zoals parodontitis. Deze methode biedt een functionele, kwantitatieve weergave van de barrièreintegriteit door gebruik te maken van grootte-afhankelijke penetratie van tracers, waardoor mechanische risicoanalyse in modellen van orale ziekten mogelijk wordt. Het ondersteunt targetvalidatie en de ontwikkeling van assays voor therapieën gericht op mucosale immuniteit en wondgenezing.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het onderzoeken van therapeutische hypothesen mogelijk met betrekking tot de epitheliale barrièrefunctie in de orale immuniteit.
- Operationele waarde: Biedt een kwantitatieve, grootte-selectieve permeabiliteitsmeting om targets die betrokken zijn bij de barrièreregulatie functioneel te valideren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt preklinische triage door verbindingen die de barrière-integriteit behouden of herstellen te onderscheiden van verbindingen die de permeabiliteit verergeren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert een functionele assay voor het beoordelen van barrièreselectiviteit met behulp van fluorescerende dextranen met gedefinieerde moleculaire gewichten (40 of 70 kDa).
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantificering mogelijk van tracerpenetratie door epitheellaagen voor compound screening.
- Klaarheid van de assay: Ondersteunt de ontwikkeling van betrouwbare, kwantitatieve read-outs voor studies naar penetratie en retentie in het orale slijmvlies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt beoordelingen van de barrièrefunctie in de ontdekkingsfase met preklinische modellen van orale ontsteking en wondgenezing.
- Ziekterelevantie: Direct toepasbaar op het modelleren van parodontitis en oraal lichen planus, waarbij barrièreverstoring een cruciaal pathogeen mechanisme is.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Maakt longitudinale monitoring van barrièreherstel of reparatie mogelijk als reactie op therapeutische interventies.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor een vroege beoordeling van de mucosale barrièrefunctie mogelijk is voordat er wordt overgegaan tot effectiviteits- en veiligheidsonderzoeken in modellen voor orale ziekten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests over de regulatie van de epitheliale barrière en immuunhomeostase in de mondholte.
- Assayontwikkeling: Genereert kwantitatieve, op beeldvorming gebaseerde resultaten voor tracerpenetratie die analyse van structuur-activiteitsrelaties faciliteren.
- Analytiek: Levert meetbare, grootte-afhankelijke permeabiliteitsgegevens waarmee testcondities en effecten van verbindingen kunnen worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen functionele barrièrebeoordeling en preklinische validatie in modellen van letsel en herstel van het mondslijmvlies.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van mucosale aflevering, retentie en barrière-modulerende middelen binnen orale R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door ambiguïteit in mechanistische verbanden tussen barrièrefunctie en orale pathologie te verminderen.
- Operationele waarde: Levert een gestandaardiseerde, beeldvormingscompatibele workflow met kwantificeerbare resultaten voor cross-functionele teams.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door vroege detectie mogelijk te maken van verbindingen die de integriteit van de gingivale barrière aantasten of herstellen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van orale therapeutica op basis van functionele resultaten van de barrière.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van oraal weefsel, de bereiding van fluorescente tracers en single-photon microscopie imaging.
- Is afhankelijk van toegang tot microscopiesystemen die in staat zijn om de penetratie van tracers door epitheellagen op te lossen.
- Maakt standaardisatie van de tracerconcentratie, incubatietijd en weefselfixatie noodzakelijk voor reproduceerbare resultaten.
- Aanpassing aan ex vivo- of andere soortmodellen kan optimalisatie van het afgiftevoertuig en de incubatieparameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de levensvatbaarheid van het weefsel na dissectie en potentiële variabiliteit in de toegankelijkheid van het gingivale oppervlak.
