Cryo-elektrontomografie workflow voor dik weefsel aangetoond bij de muishippocampus

Mijn onderzoek richt zich op het opzetten van een gestandaardiseerde cryo-ET workflow om in-situ structurele analyse van dikke weefsels zoals de muishippocampus mogelijk te maken. Bestaande methoden zijn onbetrouwbaar voor dikke weefsels, dus dit protocol integreert geoptimaliseerde stappen voor gestandaardiseerde analyse. Om te beginnen plaats je een druppel van 10 L met 10% sucroseoplossing op een schoon glas.

Ontleed snel de hippocampus van een pas geëuthanaseerde muis. Verwijder met een scherp scheermesje kleine weefselstukjes van 0,5 tot 1 kubieke millimeter. Met een tandenstoker of fijne borstel brengt u het weefsel over op de voorbereide koperen ondersteunings-TEM-roosters binnen de hogedrukvriesdrager.

Gebruik 2-methylpentaan om het weefsel vochtig te houden en de positie op het rooster aan te passen, terwijl mechanische belasting wordt geminimaliseerd om schade aan het rooster te voorkomen. Bedek vervolgens het weefsel en het rooster met een koperen folieschijf van 3 millimeter. Om de assemblage te voltooien, plaats je de tweede hogedruk-vriesdrager, met de platte kant naar beneden, bovenop om een verzegelde wafelsandwich te vormen.

Controleer de vriesparameters om zeker te zijn dat er geen afwijking in het instrument is. Zorg ervoor dat de totale tijd van weefseldissectie tot bevriezing niet hoger is dan 90 seconden. Verkrijg een nieuw gouden raster van 300 mesh als laatste ontvangerrooster voor de lift-outprocedure.

Onder een stereomicroscoop bij kamertemperatuur klem je het rooster voorzichtig in een compatibele cryo-FIB AutoGrid-ring. Bewaar vervolgens de gemonteerde AutoGrid direct in een droge oven, die op ongeveer 40 graden Celsius wordt gehouden om vorstophoping vóór gebruik te minimaliseren. Terwijl de assemblage continu in vloeibare stikstof wordt ondergedompeld, scheid je het gevitrificeerde TEM-rooster zorgvuldig van de omliggende wafelcomponenten.

Met voorgekoelde, fijn getipte pincet wrikt je de twee hoogdrukvriesdragers voorzichtig uit elkaar. Vervolgens monteer je op een voorgekoelde cryo-laadwerkstation het geïsoleerde weefselrooster in een tweede cryo-FIB AutoGrid-ring onder bescherming van vloeibare stikstof. Laad beide AutoGrids in de aangewezen sleuven van de cryo-transfer shuttle monsterhouder.

Oriënteer elke AutoGrid zodat de freesinkeping naar buiten wijst en verticaal is geplaatst om een lagere freeshoek mogelijk te maken. Houd de volledig geladen shuttle ondergedompeld in vloeibare stikstof of in een voorgekoelde toestand gehouden tot deze wordt overgebracht in de FIB-SEM. Laad de samplestage in het instrument met behulp van de sample rod.

Na cryo-transfer in de microscoop navigeer je naar het weefselrooster met lage SEM-vergroting. Vervolgens sputter je het roosteroppervlak met platina bij 30 milliampère gedurende 15 seconden om geleidende bescherming te bieden. Plaats een organometalen platinakap van 0,5 tot 1,0 micrometer dik met het gasinjectiesysteem gedurende ongeveer 60 seconden.

Breng een laatste sputter-gecoate platinalaag aan op het roosteroppervlak met 30 milliampère gedurende 15 seconden. Met behulp van het SEM-elektronenbundelbeeld navigeer je naar het geselecteerde interessegebied op het weefselrooster. Om het monster te oriënteren voor front-side frees, stel je de trap aan op ongeveer 110 graden rotatie en 7 graden helling om het monsteroppervlak onder een geschikte hoek te presenteren voor de toegang tot ionenbundel.

Voor het freezen van de greppel definieer je een rechthoekige greppel rondom het doelweefselblok met behulp van de ionenbundel die werkt op 30 kilovolt. Begin met het frezen op afstand van het blok met een relatief hoge stroom van 15 nanoampère om snelle materiaalverwijdering te bereiken. Naarmate de greppelwanden het blok tot op enkele micrometers naderen, verlaag je de ionenbundelstroom tot 7 nanoampère om een preciezere freescontrole te bereiken.

Laat één kant van het blok aan het bulkmateriaal bevestigd om een tijdelijke houdlip te creëren. Voor weefselblokken met een geschatte dikte van meer dan 20 micrometer, voer je een ondersneden freesstap uit vanaf de achterzijde om de uiteindelijke opheffing te vergemakkelijken. Draai het podium en pas de helling aan om bij de onderkant van het blok te komen.

Fres de onderzijde verbinding met de gefocuste ionenbundel op 30 kilovolt en een stroom van 3 nanoampère. Frees de onderkant van het metalen blok zodat het strak tegen het monsterblok past. Maal het contactoppervlak tussen het monster en het goudblok nauwkeurig om het contact strakker te maken.

Om het monster aan de naald te bevestigen, zorg ervoor dat het goudblok direct contact heeft met het doelmonster. Met de gefocuste ionenbundel van 30 kilovolt en 0,5 nanoampère voert u 8 tot 12 opeenvolgende dwarsdoorsnede-freespatronen uit op het grensvlak om het goudblok aan het monster te lassen. Om het weefselblok eruit te halen, snijd je het resterende lipje dat het blok met het bulkmonster verbindt af met behulp van de gefocuste ionenbundel.

Beweeg voorzichtig de micromanipulatornaald om het geïsoleerde weefselblok volledig uit de greppel en het omliggende rooster te tillen. Trek de naald terug en vervoer het blok naar het ontvangerrooster. Navigeer met de micromanipulatornaald naar een voorgekoeld 300-mesh gouden ontvangerrooster.

Laat het blok zakken op een gekozen rastervierkant. Verwijder kleine ijskristallen op het rooster om het weefselblok en rooster strakker te laten hechten. Laat het weefselblok zakken zodat het net contact maakt met het rooster.

Maal een snee van 3 tot 4 micrometer dik van het blok op de rasterfilm met behulp van de ionenbundel. Vervolgens last je de snede stevig door te frezen, waarbij je schoonmakende doorsnedepatronen aan beide zijden van de verbinding gebruikt, en breng je de geleidende en beschermende coating opnieuw aan op het roosteroppervlak zoals eerder gedemonstreerd. Voor lamellaverdunning bepaal je na het instellen van de kanteling de uiteindelijke lamellapositie binnen een glad deel van het weefselblok.

Voer systematisch freesen uit met ionenbundelstromen en over-tilt compensaties zoals gespecificeerd in de gepresenteerde tabel. Wanneer je binnen 1 tot 2 micrometer van de lamella bent, frees je eventueel een spanningsverligtingsgreppel ongeveer 1,5 micrometer verderop om te voorkomen dat de lamella buigt of krult. Na de voorbereiding van de lamella wordt beelden gemaakt met cryo-elektronenmicroscopie.

Weefselblokken die werden verwerkt door hogedrukbevriezing met de wafelmethode vertoonden een uniforme en elektronentransparante uitstraling. Reconstrueerde tomogrammen losten mitochondriale structuren binnen de cellulaire omgeving op. Macromoleculaire complexen, zoals ribosomen, werden duidelijk opgelost in het cytoplasma.

Cytoskeletale en membraan-geassocieerde cellulaire kenmerken en nucleaire poriecomplexen waren ook zichtbaar in de gereconstrueerde tomogrammen. Synaptische structuren en kenmerken, waaronder calciumvoorraden en myeline-omhulselsstructuren, waren duidelijk zichtbaar in de tomogrammen. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de natuurlijke cellulaire buitenstructuur direct binnen complexe weefselomgevingen te bestuderen.

De belangrijkste uitdaging in dit cryo-ET protocol is het bereiken van uniforme, artefactvrije vitrificatie van dikke weefselmonsters. Met deze procedure kunnen onderzoekers interessegebieden lokaliseren met correlatieve licht- en elektronenmicroscopie of labelingtechnieken, en vervolgens subtomogrammiddeling en structuuranalyse uitvoeren om macromoleculaire complexen op te lossen.