Long-read plasmidvolgordebepaling en assemblage met behulp van op nanopore sequencing gebaseerde workflows
July 7th, 2026
De huidige studie beschrijft een workflow voor nanoporesequencing van plasmiden wanneer de chromosomale sequentie al bekend is of niet van belang is. Een initiële plasmide-DNA-verrijkingsstap zorgt voor een optimale plasmidesequentiediepte en maximaliseert het aantal monsters dat per flowcel kan worden gesequenced.
We onderzoeken de replicatie, onderhoud en verspreiding van zelfreplicerende circulaire DNA-elementen, bekend als plasmiden, wat de bepaling van hun sequenties vereist. Dit protocol behandelt dekking en nauwkeurigheidskwesties geassocieerd met long-read sequencing door het verrijken van plasmide-DNA en het optimaliseren van assemblagemethoden. Ons protocol is ontworpen om plasmiden te sequentiëren in situaties waar de chromosomale sequentie ofwel bekend is of irrelevant.
Om te beginnen, streken de monsters op LB-auger platen aangevuld met het juiste antibioticum om te selecteren voor de respectieve plasmide-gedragen resistentiemarker. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag, inoculeer drie tot vijf milliliter LB-medium aangevuld met het juiste antibioticum met een enkele geïsoleerde kolonie.
Incubeer de cultuur met schudden bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer acht uur of tot de optische dichtheid bij 600 nanometer een tot twee bereikt. Inoculeer vervolgens 400 milliliter LB-medium aangevuld met het juiste antibioticum met 400 microliter van de startercultuur en incubeer zoals eerder aangetoond. Breng vervolgens de cultuur over naar centrifugeerbuisjes geschikt voor het cultuurvolume.
Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4.200 G en resuspendeer het pellet met behulp van de door de fabrikant aanbevolen reagentiavolumes. Na cellyse en neutralisatie, centrifugeer het lysate gedurende 30 minuten bij 4.200 G. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis en centrifugeer het opnieuw.
Voer evenwichtsbepaling, wassen en DNA-elutie uit volgens de instructies van de fabrikant. Resuspendeer vervolgens het geprecipiteerde DNA in 100 microliter nuclease-vrij water om de concentratie voor nanopore bibliotheekvoorbereiding te maximaliseren. Bereid vervolgens de testbuisjes voor om de DNA te kwantificeren volgens de gepresenteerde tabel.
Na kalibratie van de fluorometer, plaats de monsterbuisjes in de fluorometer en noteer de metingen volgens de instrumenthandleiding. Programmeer de thermische cycler naar 30 graden Celsius gedurende twee minuten, gevolgd door 80 graden Celsius gedurende twee minuten. Draai en meng de ontdooide kitcomponenten volgens de gepresenteerde tabel.
Incubeer de voor barcodering voorbereide PCR-buisjes met behulp van het thermische cycler-programma. Plaats vervolgens de buisjes op ijs om af te koelen. Bundel de gebarcodeerde monsters in een schone 1,5 milliliter Eppendorf-buis, zorg ervoor dat het totale volume niet meer dan 1.000 microliter overschrijdt.
Zodra de kralen gevortexed zijn, voeg een gelijk volume kralen toe aan de gebundelde gebarcodeerde monsters. Meng door de buis te flikkeren, gevolgd door een 10 minuten durende incubatie. Was vervolgens de kralen met één milliliter 80% ethanol terwijl ze op de magneet liggen.
Verwijder de ethanol en herhaal dit eenmaal. Verwijder de buis van de magneet. Resuspendeer de kralen in elutiebuffer met behulp van het juiste volume op basis van het aantal gebruikte barcodes en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Kwantificeer de DNA-concentratie met behulp van één microliter van het eluteerde monster op de fluorometer om succesvolle bibliotheekvoorbereiding te bevestigen. Voor adapterligatie, draag 11 microliter van de DNA-bibliotheek over naar een nieuwe buis en label deze. Meng vervolgens de gepresenteerde componenten in een verse buis om de ontdooide snelle adapter te verdunnen.
Voeg vervolgens één microliter verdunde snelle adapter toe aan de 11 microliter DNA-bibliotheek en flikker de buis om de inhoud te mengen. Draai de buis kort door om ervoor te zorgen dat het volledige volume zich op de bodem verzamelt en incubeer de buis vijf minuten op de werkbank. Bereid de flow cell priming mix voor in een verse DNA-buis en meng door omkeren en pipetten.
Til het deksel van het apparaat op en plaats de flow cell erin terwijl u zachte druk uitoefent om een juiste plaatsing te garanderen. Controleer op luchtbellen binnen of naast de priming poort en trek vervolgens 20 tot 30 microliter vloeistof terug om luchtbellen te verwijderen. Trek vervolgens 800 microliter priming mix op en giet deze in de priming poort terwijl u luchtbellen vermijdt en laat het apparaat vijf minuten staan.
Meng de DNA-bibliotheek met het juiste volume aan bibliotheekkralen in een nieuwe buis zoals hier gepresenteerd. Laad 200 microliter priming mix in de flow cell priming poort. Pas de deksel van de monsterpoort aan om de poort te onthullen.
Druppel 75 microliter van de DNA-bibliotheek met kralen één druppel per keer in de monsterpoort, waarbij u elke druppel laat absorberen voordat u de volgende toevoegt. Breng vervolgens het deksel van de monsterpoort weer aan en sluit de priming poort. Zodra het deksel van het apparaat gesloten is, begint u met de sequencing-run.
Stel de runtimelimiet in op basis van het aantal gemultiplexte plasmiden met een standaard van 48 uur en een maximum van 72 uur. Selecteer de supernauwkeurige base calling-modus en de juiste snelle barcodekit-optie. Selecteer vervolgens de ruwe FAST5 of POD5 gegevens en start het base calling.
Om een gefilterd FASTQ-bestand voor downstream assemblage te genereren, trimt u lange lezingen met behulp van Filtlong om ongeveer 5-10%van de lezingen met de laagste kwaliteit te verwijderen terwijl ongeveer 90%van de totale opbrengst wordt behouden. Subsample lezingen met behulp van Autocycler volgens aanbevolen instellingen. Assembleer elke leessubset met Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler en andere geselecteerde assemblers.
Visualiseer elk assemblagegrafiekbestand met behulp van bandage. Evalueer contigs op circulariteit, grootteconsistentie tussen assemblers en bewijs van chimerische verbindingen. Verwijder lineaire contigs zonder ondersteuning over meerdere assemblers en behoud circulaire contigs met consistente grootteschattingen.
Verwijder kleine niet-ondersteunde contigs vóór consensusgeneratie wanneer grote plasmiden zijn gecirculariseerd. Ga door naar consensusgeneratie na handmatige curatie. Genereer de consensussequentie met behulp van Autocycler met de samengestelde assemblages.
Voer de resterende Autocycler-opdrachten uit om de definitieve consensus
Overview
This article presents a detailed workflow for nanopore sequencing aimed at maximizing plasmid DNA yield and sequencing accuracy. The protocol encompasses plasmid extraction, rapid barcoding, adapter ligation, sequencing, and sequence assembly, and is suitable for a wide range of plasmid sizes and levels of chromosomal contamination. The method is demonstrated using Escherichia coli as a model organism.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- Genomics
- Microbiology
Background
- Plasmid sequencing is essential for genetic studies, recombinant gene expression, and plasmid capture experiments.
- Traditional sequencing methods may be limited by chromosomal contamination and low plasmid yield.
- Nanopore sequencing offers long-read capabilities and real-time data acquisition.
- Efficient workflows are needed to optimize plasmid sequencing throughput and accuracy.
Purpose of Study
- To develop and describe a robust workflow for nanopore-based plasmid sequencing.
- To maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy.
- To enable efficient parallel sequencing of multiple samples.
Methods Used
- Plasmid DNA extraction from clinical E. coli strains.
- Library preparation using rapid barcoding and adapter ligation.
- Loading libraries onto a nanopore flow cell for sequencing.
- Base calling performed in real time or post-hoc.
- Sequence assembly using Autocycler.
- Comparison of assemblies to gel mobility and short-read polished assemblies.
Main Results
- Plasmid assemblies matched sizes inferred from gel mobility.
- In two-thirds of cases, assemblies matched or closely resembled short-read polished assemblies (within 0.05% pairwise identity).
- Protocol supports plasmids from 4 to 174 kb in size.
- Up to 72% chromosomal contamination tolerated without loss of accuracy.
- Parallel sequencing of up to 24 samples achieved with optimal coverage.
Conclusions
- The workflow enables accurate and efficient plasmid sequencing using nanopore technology.
- It is suitable for plasmid verification, improving WGS-derived plasmid sequences, and sequencing plasmids captured by conjugation.
- The protocol is robust to chromosomal contamination and applicable to a range of plasmid sizes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Long-read nanopore plasmid sequencing enables high-confidence verification and assembly of plasmid constructs, supporting critical quality control and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This workflow addresses the challenge of chromosomal contamination and variable plasmid yield, providing robust, scalable solutions for recombinant DNA and gene therapy vector development. Its parallelization and tolerance for mixed DNA inputs streamline early discovery and preclinical workflows, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of engineered plasmids for functional studies and target validation.
- Reduces ambiguity in construct identity, supporting mechanistic de-risking in discovery biology.
- Facilitates rapid triage of candidate constructs for downstream screening or expression.
Screening & Assay Development
- Provides validated sequence data for assay-ready plasmids, ensuring reproducibility in screening campaigns.
- Supports parallel sequencing of up to 24 samples, increasing throughput for construct libraries.
- Delivers quantitative sequence accuracy, enabling reliable comparison across engineered variants.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical studies by confirming plasmid integrity in disease-relevant systems.
- Enables sequence verification for plasmids used in gene delivery or biomarker studies.
- Supports risk-adjusted advancement by minimizing sequence-related uncertainties in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based workflow integrates from early construct verification through screening and preclinical validation, supporting both hypothesis-driven and translational research pipelines.
- Discovery Biology: Confirms plasmid sequence fidelity, reducing risk of off-target effects in functional assays.
- Screening: Ensures assay-ready constructs are sequence-verified, supporting reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides high-accuracy, quantitative sequence data for cross-sample comparison and quality control.
- Translational Research: Aligns plasmid sequence verification with preclinical model requirements for gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, parallelizable sequencing capability adaptable across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct-driven studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes plasmid verification, tolerates high chromosomal contamination, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring construct integrity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmid extraction, library preparation, and nanopore sequencing workflows.
- Demands computational infrastructure scaled to real-time or post-hoc basecalling needs.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of plasmid sizes and host backgrounds, including high chromosomal DNA content.
- Best suited for applications where chromosomal sequence is known or not required.
