Long-read plasmidvolgordebepaling en assemblage met behulp van op nanopore sequencing gebaseerde workflows
7 juli 2026
De huidige studie beschrijft een workflow voor nanoporesequencing van plasmiden wanneer de chromosomale sequentie al bekend is of niet van belang is. Een initiële plasmide-DNA-verrijkingsstap zorgt voor een optimale plasmidesequentiediepte en maximaliseert het aantal monsters dat per flowcel kan worden gesequenced.
We onderzoeken de replicatie, het onderhoud en de verspreiding van zelfreplicerende circulaire DNA-elementen, bekend als plasmiden, wat de bepaling van hun sequenties noodzakelijk maakt. Dit protocol pakt dekkings- en nauwkeurigheidsproblemen aan die samenhangen met long-read sequencing door plasmide-DNA te verrijken en assemblagemethoden te optimaliseren. Ons protocol is ontworpen om plasmiden te sequencen in situaties waarin de chromosomale sequentie bekend of irrelevant is.
Om te beginnen streep je de monsters op LB-boorplaten aangevuld met het juiste antibioticum om te selecteren op de respectievelijke plasmidgedragen resistentiemarker. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De volgende dag inoculeer je drie tot vijf milliliter LB medium, aangevuld met het juiste antibioticum met één geïsoleerde kolonie.
Incubeer de cultuur met schudden bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer acht uur of totdat de optische dichtheid bij 600 nanometer één tot twee bereikt. Vervolgens inoculeer je 400 milliliter LB-medium, aangevuld met het juiste antibioticum met 400 microliter van de startercultuur, en incubeer je zoals eerder aangetoond. Vervolgens doe je de cultuur over in centrifugeflessen die passen bij het kweekvolume.
Centrifugeer op 4.200 G gedurende 10 minuten en suspendeer de pellet opnieuw met behulp van de door de fabrikant aanbevolen reagensvolumes. Na cellyse en neutralisatie centrifugeer je het lysaat op 4.200 G gedurende 30 minuten. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis en centrifugeer het opnieuw.
Voer evenwicht, wasbeurt en DNA-eluering uit volgens de instructies van de fabrikant. Daarna wordt het neergeslagen DNA opnieuw opgehangen in 100 microliter nucleasevrij water om de concentratie voor de nanoporebibliotheekvoorbereiding te maximaliseren. Om vervolgens het DNA te kwantificeren, bereid je de assaybuizen voor zoals in de gepresenteerde tabel.
Na het kalibreren van de fluorometer steek je de monsterbuizen in de fluorometer en noteer je de metingen volgens de instrumentenhandleiding. Programmeer de thermische cycler op 30 graden Celsius gedurende twee minuten, gevolgd door 80 graden Celsius gedurende twee minuten. Draai en meng de ontdooide kitonderdelen volgens de gepresenteerde tabel.
Incubeer de PCR-buizen die zijn voorbereid voor barcode met behulp van het thermische cyclerprogramma. Zet de buizen dan op ijs om af te koelen. Combineer de gebarcodede monsters in een schone Eppendorf-buis van 1,5 milliliter, zodat het totale volume niet meer dan 1.000 microliter bedraagt.
Zodra de kralen zijn gevortexed, voeg je een gelijke hoeveelheid kralen toe aan de gepoolde barcodemonsters. Meng door de buis te knippen, gevolgd door een incubatie van 10 minuten. Was daarna de kralen met één milliliter 80% ethanol terwijl je op de magneet zit.
Verwijder de ethanol en herhaal één keer. Haal de buis van de magneet. Stil de kralen opnieuw in elutiebuffer met het juiste volume gebaseerd op het aantal gebruikte barcodes en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
Kwantificeer de DNA-concentratie met één microliter van het geëlde monster op de fluorometer om succesvolle bibliotheekvoorbereiding te bevestigen. Voor adapterligatie breng je 11 microliter van de DNA-bibliotheek over in een nieuw buisje en label dit. Meng vervolgens de gepresenteerde componenten in een verse buis om de ontdooide rapid adapter te verdunnen.
Voeg vervolgens één microliter verdunde rapid adapter toe aan de 11 microliter DNA-bibliotheek en tik de tube om de inhoud te mengen. Draai de buis kort naar beneden om te zorgen dat het volledige volume aan de onderkant wordt verzameld en laat de buis vijf minuten op de bank incuberen. Bereid het flow cell priming-mengsel voor in een verse DNA-buis en meng door inversie en pipetten.
Til het deksel van het apparaat op en plaats de flowcel erin terwijl je zachte druk uitoefent om een juiste plaatsing te garanderen. Na het controleren van luchtbellen binnen of naast de primingpoort, trek je 20 tot 30 microliter vloeistof terug om de belletjes te verwijderen. Haal dan 800 microliter primingmengsel op en doop het in de primingpoort zonder luchtbellen te voorkomen en laat het apparaat vijf minuten staan.
Meng de DNA-bibliotheek met het juiste volume bibliotheekkralen in een nieuwe buis zoals hier gepresenteerd. Laad 200 microliter primingmengsel in de flowcel-primingpoort. Stel de deksel van de samplepoort aan om de poort te onthullen.
Doseer 75 microliter van de DNA-bibliotheek met kralen druppel voor druppel in de monsterpoort, zodat elke druppel kan worden opgenomen voordat je de volgende toevoegt. Breng dan de sample port cover opnieuw aan en sluit de priming poort. Zodra het deksel van het apparaat gesloten is, begin je met de sequencing-run.
Stel de runtime-limiet in op basis van het aantal plasmiden dat gemultiplext wordt, met een standaard van 48 uur en een maximum van 72 uur. Kies de supernauwkeurige basisbelmodus en de juiste optie voor een snelle barcodekit. Selecteer vervolgens de ruwe FAST5- of POD5-data en begin met het basiscallen.
Om een gefilterd FASTQ-bestand te genereren voor downstream assemblage, trim je lange reads met Filtlong om ongeveer 5-10% van de laagste kwaliteit reads te verwijderen, terwijl ongeveer 90% van de totale opbrengst behouden blijft. Subsample reads met Autocycler volgens de aanbevolen instellingen. Assembleer elke read subset met behulp van Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler en andere geselecteerde assemblers.
Visualiseer elk assembly-grafiekbestand met verband en verband. Evalueer contigs op circulariteit, grootteconsistentie tussen assemblers en bewijs van chimerische gewrichten. Verwijder lineaire contigs die geen ondersteuning hebben over meerdere assemblers en behoud cirkelvormige contigs met consistente grootteschattingen.
Verwijder kleine niet-ondersteunde contigs vóór consensusgeneratie wanneer grote plasmiden circulariseerd zijn. Ga door met consensusgeneratie na handmatige curatie. Genereer de consensusvolgorde met Autocycler met de gecureerde assemblies.
Voer de resterende Autocycler-commando's uit om de uiteindelijke consensus-plasmidesequentie te produceren. Tot slot polijst je de eindassemblage met getrimde lange leessessies met Medaka om de consensusnauwkeurigheid te verbeteren. Alle conjugatie-assays produceerden transconjuganten, wat de aanwezigheid van een conjugatief plasmide in de donoren bevestigde.
De groottes van geassembleerde plasmidesequenties waren overeenkomend met schattingen gebaseerd op de mobiliteit van pulsveldgel-elektroforese. Nanopore-sequencing leverde voldoende leesoutput en kwaliteit op voor alle geanalyseerde monsters. De chromosomale besmettingspercentages varieerden tussen 72,1% en 28,0% met een gemiddelde van 46,9%. Pulsveldgelelektroforese-analyse van stamplasmide UPEC_271 een band die overeenkomt met een plasmide van ongeveer 145 kilobasenparen.
DNA van een van de transconjuganten toonde een sequentie identiek aan de 145 kilobasen. Pulsveldgel-elektroforeseanalyse van stambloed 100913 twee plasmiden van ongeveer 70 en 110 kilobasenparen geïdentificeerd. Nanoporesequencing bevestigde twee plasmidassemblages van 71.182 basenparen en 111.226 basenparen.
De belangrijkste overweging is of de chromosomale sequentie van belang is. Zo ja, dan zijn standaard protocollen voor volledige genoomsequencing beter. De verhoogde dekking van ons protocol opent de deur naar het bestuderen van heteroplasmatie, oftewel.
plasmidesequentievariatie binnen een bepaalde populatie.
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerde workflow voor nanopore-sequencing, gericht op het maximaliseren van de opbrengst aan plasmide-DNA en de nauwkeurigheid van de sequencing. Het protocol omvat plasmide-extractie, snelle barcoding, adapterligatie, sequencing en sequentie-assemblage, en is geschikt voor een breed scala aan plasmidegroottes en gradaties van chromosomale contaminatie. De methode wordt gedemonstreerd met Escherichia coli als modelorganisme.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Moleculaire biologie
- Genomics
- Microbiologie
Achtergrond
- Plasmidsequencing is essentieel voor genetische studies, recombinante genexpressie en experimenten voor plasmidcapture.
- Traditionele sequentiemethoden kunnen beperkt worden door chromosomale contaminatie en een lage plasmidopbrengst.
- Nanopore-sequencing biedt mogelijkheden voor long-read sequencing en realtime data-acquisitie.
- Efficiënte workflows zijn nodig om de doorvoer en nauwkeurigheid van plasmidsequencing te optimaliseren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen en beschrijven van een robuuste workflow voor nanopore-gebaseerde plasmidsequencing.
- Het maximaliseren van de opbrengst aan plasmid-DNA en de nauwkeurigheid van de sequencing.
- Het mogelijk maken van efficiënte parallelle sequencing van meerdere monsters.
Gebruikte methoden
- Plasmid-DNA-extractie uit klinische E. coli-stammen.
- Bibliotheekpreparatie met behulp van snelle barcoding en adapterligatie.
- Laden van bibliotheken op een nanopore flowcell voor sequencing.
- Base calling uitgevoerd in real-time of post-hoc.
- Sequence-assemblage met behulp van Autocycler.
- Vergelijking van assemblages met gelmobiliteit en gepolijste short-read-assemblages.
Belangrijkste resultaten
- Plasmidassemblages kwamen overeen met de grootten afgeleid van de gelmobiliteit.
- In tweederde van de gevallen kwamen de assemblages overeen met of leken ze sterk op short-read gepolijste assemblages (binnen 0,05% pairwise identity).
- Het protocol ondersteunt plasmiden met een grootte van 4 tot 174 kb.
- Tot 72% chromosomale contaminatie werd getolereerd zonder verlies van nauwkeurigheid.
- Parallelle sequencing van maximaal 24 monsters werd bereikt met een optimale dekking.
Conclusies
- De workflow maakt nauwkeurige en efficiënte plasmidsequencing mogelijk met behulp van nanopore-technologie.
- Het is geschikt voor plasmidverificatie, het verbeteren van plasmidsequenties afgeleid van WGS en het sequencen van plasmiden die via conjugatie zijn gevangen.
- Het protocol is ongevoelig voor chromosomale contaminatie en toepasbaar op diverse plasmidgroottes.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Long-read nanopore-plasmidsequencing maakt een betrouwbare verificatie en assemblage van plasmidconstructen mogelijk, wat essentieel is voor kwaliteitscontrole en het minimaliseren van mechanische risico's in biofarmaceutisch R&D. Deze workflow pakt de uitdagingen aan van chromosomale contaminatie en variabele plasmidopbrengsten, en biedt robuuste, schaalbare oplossingen voor de ontwikkeling van recombinant DNA en gentherapievectoren. De parallellisatie en tolerantie voor gemengde DNA-inputs stroomlijnen vroege discovery- en preklinische workflows, waardoor de besluitvorming over de portfolio wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Maakt precieze verificatie van gemodificeerde plasmiden mogelijk voor functionele studies en doelwitvalidatie.
- Vermindert onduidelijkheid over de identiteit van constructen, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in discovery biology.
- Faciliteert snelle triage van kandidaat-constructen voor downstream screening of expressie.
Screening & assay-ontwikkeling
- Levert gevalideerde sequentiegegevens voor assay-klare plasmiden, wat de reproduceerbaarheid in screeningcampagnes waarborgt.
- Ondersteunt parallelle sequenering van maximaal 24 monsters, waardoor de doorvoer voor constructiebibliotheken wordt verhoogd.
- Biedt kwantitatieve sequentienauwkeurigheid, wat een betrouwbare vergelijking tussen gemanipuleerde varianten mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Verbetert de continuïteit van ontdekking naar preklinische studies door de integriteit van plasmiden in ziekterelevante systemen te bevestigen.
- Maakt sequentieverificatie mogelijk voor plasmiden die worden gebruikt in genoverdracht- of biomarkerstudies.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door sequentie-gerelateerde onzekerheden in preklinische modellen te minimaliseren.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze nanopore-gebaseerde workflow integreert stappen van vroege constructverificatie tot screening en preklinische validatie, ter ondersteuning van zowel hypothesegestuurde als translationele onderzoekspijplijnen.
- Discovery Biology: Bevestigt de getrouwheid van de plasmide-sequentie, waardoor het risico op off-target effecten in functionele assays wordt verminderd.
- Screening: Garandeert dat assay-klare constructen sequentie-geverifieerd zijn, wat bijdraagt aan een reproduceerbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert nauwkeurige, kwantitatieve sequentiegegevens voor vergelijkingen tussen monsters en kwaliteitscontrole.
- Translationeel onderzoek: Stemt de verificatie van de plasmide-sequentie af op de vereisten voor preklinische modellen voor genexpressiestudies.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een schaalbare, parallelliseerbare sequentiecapaciteit die aanpasbaar is voor diverse R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in construct-gestuurde studies en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardiseert de plasmidverificatie, is bestand tegen hoge chromosomale contaminatie en ondersteunt high-throughput workflows.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go beslissingen mogelijk door de integriteit van het construct te waarborgen vóór downstream investeringen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van gen-gebaseerde assets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in plasmidextractie, library-preparatie en nanopore sequencing-workflows.
- Vereist een computationele infrastructuur die is geschaald naar real-time of post-hoc basecalling-behoeften.
- Profiteert van gestandaardiseerde protocollen voor reproduceerbaarheid tussen teams en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan een reeks plasmidgroottes en gastheerachtergronden, inclusief een hoog chromosomaal DNA-gehalte.
- Meest geschikt voor toepassingen waarbij de chromosomale sequentie bekend is of niet vereist is.
