Site-specifieke lysinelactylering via genetische code-expansie in E. coli - en zoogdiercellen

We ontwikkelden een klok/RS tRNA-systeem om mimicrie- en enzymbeperkingen te overwinnen, waardoor nauwkeurige inbouw van lysinelactylatie mogelijk is om de biologische bestudering ervan te bestuderen. Dit protocol kan worden toegepast om tumormetabolisme, enzymfuncties en klokplaatsen te bestuderen. Om te beginnen co-transformeer je 50 microliter chemisch competente cellen van Escherichia coli DH10B met ongeveer 100 nanogram elk van de gewenste plasmiden. Incubeer het transformatiemengsel 25 minuten op ijs en geef het dan een hitteshock op 42 graden Celsius gedurende 45 seconden.

Zet de buis drie minuten terug in het ijs. Voeg 350 microliter Luria bertani medium toe en schud de buis krachtig met 220 omwentelingen per minuut gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Verspreid nu de getransformeerde celcultuur op een Luria bertani agarplaat, aangevuld met ampicilline en chloramfenicol.

Bred de plaat uit bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur. Vervolgens kies je een enkele kolonie van de plaat om een startercultuur van vier milliliter te inoculeren en deze een nacht uit te couberen. De volgende dag breid je de nachtkweek uit tot 400 milliliter Luria bertani medium met ampicilline en chloramfenicol.

Schud de cultuur krachtig met 220 omwentelingen per minuut en 37 graden Celsius totdat de optische dichtheid bij 600 nanometer tussen 0,6 en 0,8 ligt. Vervolgens induceer je de kweek met 0,2% L-Arabinose en één millimolaire lactyllysine en incubeer je bij 30 graden Celsius en 220 omwentelingen per minuut gedurende 16 uur. Zaadcellen vormen een 12-put plaat met een dichtheid van één keer 10 tot de kracht van vijf cellen per put, met gebruik van één milliliter DMEM.

Incubeer 24 uur totdat de celconfluentie tussen de 70 en 80% ligt en ga daarna over tot transfectie. Om de verdunde DNA-oplossing te bereiden, voeg 0,75 microgram plasmide met sfGFP-reporter en pNeu-KlacRS in een één-op-één verhouding toe aan 38 microliter serumvrije DMEM met hoge glucose. Pipetteer voorzichtig op en neer of vortex kort om te mengen.

Om het verdunde transfectiereagens te bereiden, voeg je 2,25 microliter transfectiereagens toe aan 38 microliter serumvrije DMEM met een hoge glucose. Pipetteer voorzichtig drie tot vier keer omhoog en omlaag om het goed te mengen. Voeg onmiddellijk het verdunde transfectiereagens in één keer toe aan de verdunde DNA-oplossing.

Pipetteer nu drie tot vier keer omhoog en omlaag om de inhoud te mengen en de oplossing 10 tot 15 minuten op kamertemperatuur te laten incuberen, zodat de transfectie en DNA-complexen kunnen ontstaan. Voeg 50 microliter van de transfectie en het DNA-complex druppelwijs toe aan het medium in elke put en draai de plaat voorzichtig om het mengsel te homogeniseren. Zes uur na transfectie vervang je het medium door verse DMEM met één millimolaire lactyllysine en kweek je de cellen gedurende 24 tot 48 uur.

Bij Escherichia coli werd hENO1-89Klac in de volledige lengte geproduceerd wanneer één millimolaire lactyllysine aan het groeimedium werd toegevoegd. Immunoblotting bevestigde de aanwezigheid van volledige hENO1-89Klac met behulp van anti-His tag en anti-L-lactyl lysine-antilichamen. De elektrospray-ionisatietijd van de vlucht massespectrometrie toonde een dominante piek van 48.178 Daltons, wat overeenkwam met de verwachte massa van hENO1-89Klac zonder het initierende methionine.

Tandem-massaspectrometrie van de triptych-digest bevestigde site-specifieke opname van Klac bij Residu 89 door de aanwezigheid van een volledige B&Y-ionenreeks die op het gemodificeerde peptide werd afgebeeld. In zoogdiercellen HEK293T vertoonde fluorescentiemicroscopie een sterke sfGFP-expressie in de cellen wanneer Klac 24 en 48 uur werd toegevoegd, terwijl er geen fluorescentie werd waargenomen zonder Klac-suppletie. Flowcytometrie toonde aan dat ongeveer 31% van de cellen sfGFP tot expressie bracht na 24 uur, met een toename tot ongeveer 37% na 48 uur Klac-supplementatie.

Dit protocol maakt het mogelijk om locatie-specifieke lysinelactylatie-effecten op de eiwitfunctie te onderzoeken en vergemakkelijkt de meting van resulterende biologische en functionele uitkomsten. Met deze procedure kunnen onderzoekers mechanistische studies uitvoeren, high-throughput screening-assays uitvoeren en stabiele cellijnen genereren voor uitgebreide functionele analyse. Onze toekomstige studies zijn gericht op het verbeteren van efficiëntie, het mogelijk maken van stabiele integratie en het ontwikkelen van klokbiosynthese.