Cervicale lymfebuis-gecoruleerde rat-model voor het beoordelen van lymfetransport vanuit het hoofd en de hersenen

Ons project onderzoekt hoe hersenlymfatica zich verhouden tot aandoeningen van het centrale zenuwstelsel (CNS), zoals Alzheimer, beroerte en neuro-ontsteking, door stoffen te identificeren die uit de hersenen afvoeren. Bestaande methoden misten een protocol en een betrouwbare benadering om theoretisch CNS-afgeleide lymfatische uitstroming te bemonsteren en te kwantificeren, wat door dit protocol mogelijk wordt gemaakt. Begin met ongeveer 0,7 milliliter verdunde antistollingsoplossing vooraf in een steriele insulinespuit van één milliliter met een naald van 30 gauge om het binnenoppervlak van de polyethyleencanule te bedekken.

Bewaar de voorgeladen spuit onder steriele omstandigheden tot gebruik. Om canules te bereiden, gebruik tubing met een buitendiameter van 0,5 millimeter en 0,3 millimeter binnendiameter voor beide terminalsecties en een buitendiameter van 0,6 millimeter en buis met een binnendiameter van 0,5 millimeter voor het middengedeelte. Met een schaar knip je de canulesegmenten tot lengtes van twee centimeter voor het proximale gedeelte dat met de spuitnaald verbonden is, 40 centimeter voor het middelste gedeelte en acht centimeter voor het distale deel dat bedoeld is voor cannulation.

Zet de canule in elkaar in een kop-naar-staart-configuratie. Snijd vervolgens het distale uiteinde van de canule af en schuin onder een hoek van ongeveer 45 graden om een soepele inbreng in de cervicale lymfebuis te vergemakkelijken. Controleer de openheid van elke canule door de voorgeladen spuit aan te sluiten op het proximale uiteinde van de gemonteerde canule.

Laat voorzichtig een klein volume oplossing los om de canule door te spoelen. Zorg ervoor dat de oplossing soepel uit het distale uiteinde komt zonder tekenen van lekkage. Plaats een verdoofde rattenrugligging op een verwarmd chirurgisch kussen dat op 37 graden Celsius wordt gehouden.

Kantel het hoofd en strek de nek met een klein ondersteunend kussen, indien nodig, om de blootstelling van het cervicale gebied te vergroten. Beperk de voorpoten voorzichtig met elastiekjes of chirurgische tapes om beweging te minimaliseren. Spoel de vacht over het baarmoederhalsgebied met steriele normale zoutoplossing om het scheren te vergemakkelijken.

Scheer vervolgens de hele operatieplek grondig om de vacht volledig te verwijderen vóór de incisie. Markeer de operatielocatie door een stippellijn van 2,5 centimeter te tekenen om de lengte van de initiële incisie te bevestigen. Plaats het bovenste uiteinde van de incisie ongeveer één tot 1,5 centimeter onder de onderlip.

Na het bevestigen van de anesthesiediepte met de teenknijpreflex, snijd zorgvuldig de oppervlakkige laag van de cervicale spier langs de gemarkeerde lijn. Scheid vervolgens voorzichtig de resterende spierlagen, voornamelijk de oppervlakkige cervicale fascia, om de cervicale slagader bloot te leggen. Trek de sternomastoideus en de submandibulaire klier terug en kantel ze van het operatieveld om de identificatie van de cervicale lymfebuis te vergemakkelijken.

Gebruik een weefseluitbreider om het operatievenster te behouden. Houd met een wattenstaafje tijdelijk spierweefsel apart terwijl je de lymfeklier en de bijbehorende lymfebuis lokaliseert. Lokaliseer de ondoorzichtige, kleurloze cervicale lymfebuis die parallel loopt aan de halsslagader.

Met een stompe tang laat je voorzichtig door het gescheiden bindweefsel gaan en houd je de pincet op zijn plek. Isoleer zorgvuldig de cervicale lymfebuis van omliggende bind- en vetweefsel door middel van een stomp dissectie. Maak vervolgens een kleine incisie in de bovenste helft van het blootgestelde vat.

Een kleine secundaire huidpunctie op ongeveer 1,5 centimeter van het operatievenster kan worden gemaakt als extra fixatiepunt voor de canule. Steek de canule door de tweede opening, grijp het distale uiteinde met een tang vast en zorg dat het afgeschuinde vlak omhoog is gericht. Vervolgens breng je het distale uiteinde voorzichtig ongeveer twee millimeter in de lymfebuis via de incisie, zodat het naar het hoofd wordt gericht.

Houd het proximale uiteinde van de canule één tot twee minuten in de gaten. Bevestig geslaagde canulatie door een langzame en gestage uitstroom van lymfevocht te observeren. Bevestig de canule door een kleine druppel cyanoacrylaatlijm aan te brengen met een pipet op de incisieplaats en het secundaire fixatiegat.

Observeer de lymfestroom enkele minuten om een stabiele uitstroom te bevestigen. Verwijder vervolgens voorzichtig de weefselexpander en herplaats de submandibulaire klier op de oorspronkelijke plek. Bevestig een vooraf gelabelde, met antistollingsmiddelen gecoate microcentrifugebuis aan het distale uiteinde van de canule.

Verplaats vervolgens alle spierlagen naar hun oorspronkelijke plek, en sluit de huidincisie met hechtingen en/of weefsellijm. Verzamel lymfe continu in microcentrifugebuizen met antistollingsmiddelen, waarbij je de buizen op vooraf bepaalde intervallen vervangt, meestal elk uur. Zorg ervoor dat de rat gedurende de hele verzamelperiode onder narcose blijft.

Bewaar de verzamelde monsters met ijszakken in een koelbox. De uurlijkse lymfestromen gemeten over een verzamelperiode van zes uur bij succesvol gecanuleerde ratten varieerden van 0,09 tot 0,13 milliliter per uur. Bij gezonde ratten bleef cumulatief lymfatisch transport van intrastriataal toegediend, tritiumgelabeld albumine tijdens de eerste twee uur verwaarloosbaar en nam daarna aanzienlijk toe.

Vergelijking van tritium-gelabelde albumineconcentraties tussen lymfe en plasma toonde verschillende concentratieprofielen in de loop van de tijd bij gezonde ratten aan. Neuroontsteking veroorzaakt door interperitoneale toediening van Escherichia coli lipopolysaccharide was geassocieerd met een licht verminderde algehele lymfestroom over acht uur en een bijna verdubbeling van het aandeel van de totale dosis dat in lymfe werd getransporteerd. De concentratieverhouding van lymfe tot plasma toonde geen significant verschil tussen gezonde en neuro-ontstoken ratten, wat wijst op vergelijkbare cervicale lymfatische clearanceprofielen.

Dit protocol maakte directe biologische bemonstering van hersenafgeleide lymfe mogelijk, waarbij indirecte externe beeldvorming of harsmethode werd overbrugd met meetbare uitstroom van het centrale zenuwstelsel. Het protocol maakt het mogelijk om centraal toegediende geneesmiddelclearance via lymfebanen te bestuderen, waardoor afvoerroutes en clearancepercentages gemeten kunnen worden. Toekomstige studies kunnen onderzoeken hoe CNS-ziekten waarschuwen voor lymfatische clearance en deze kennis gebruiken om medicijnen te optimaliseren die de lymfatische functie van de hersenen herstellen voor behandeling.