Infant Immuniteit in kaart brengen met minimale input: Integratieve single-cell en multiomic profiling

Ons onderzoek definieert hoe de immuniteit in het vroege leven zich na de geboorte aanpast met behulp van longitudinale hoog-dimensionale multiomische profilering uit kleine bloedvolumes. Dit protocol kan worden toegepast op neonatale en pediatrische studies voor longitudinale immuunprofilering uit beperkte biospecimens op het gebied van gezondheid, infectie en ontsteking. Om te beginnen ontdooi je snel een flesje met gelyseerde rode bloedcellen van zuigelingen in een waterbad van 37 graden Celsius.

Breng de ontdooide cellen over in een 15-milliliter conische buis met 10 milliliter warm volledig RPMI-medium bij 37 graden Celsius. Centrifugeer de buis op 400 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Susselt de celpellet opnieuw in drie milliliter volledig RPMI-medium en tel het totale aantal cellen.

Verdun het monster als de concentratie te hoog is om te tellen. Na het tellen van de cellen herhaal je de centrifugatiestap en suspendeer je de cellen opnieuw in een volledig RPMI-medium om een concentratie van één miljoen cellen per milliliter te verkrijgen. Breng 100 microliter met 0,1 miljoen cellen over in elke put van een 96-put V-bodemplaat.

Centrifugeer de plaat op 764 g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 100 microliter levende dode kleurstof toe, verdund van één tot 2.000 in PBS met FC-blok en monocytblok verdund één tot 100 aan alle monsters behalve de ongekleurde controle.

Incubeer de monsters 15 minuten bij vier graden Celsius. Om de cellen te wassen, voeg je 100 microliter PBS toe. Centrifugeer de plaat op 764 g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant voorzichtig weg.

Voeg 100 microliter oppervlakte-antistofcocktail, verdund één tot 200 in fluorescentie-geactiveerde celsortering, of FACS-buffer, toe aan alle monsters behalve de ongekleurde controle. Breng 30 minuten uit bij vier graden Celsius. Was vervolgens de cellen met 100 microliter FACS-buffer, centrifugeer en gooi het supernatant weg.

Herstel de cellen door 100 microliter 4% paraformaldehyde aan elk monster toe te voegen. Broed 15 minuten uit op kamertemperatuur in het donker, was daarna de cellen opnieuw en suspensieer opnieuw in 200 microliter FACS-buffer. Bereid UltraComp-compensatiekralen voor als eenkleurige controles.

Beits de eenkleurige controlekralen met dezelfde procedure als de monsters, inclusief fixatie als de monsters vastzitten. Bereid ook fluorescentie min één of FMO-controles op dezelfde manier voor. Voer de monsters, eenkleurige controles, ongekleurde controles en fluorescerend minus-één controles uit op een conventionele of spectrale flowcytometer.

Open FlowJo en selecteer het geïnteresseerde monster om te analyseren. Stel poorten in met de juiste isotype- en FMO-besturingen. Gateleukocyten met FSC versus SSC om afval uit te sluiten, en selecteer cellen op grootte en granulariteit.

Sluit dubbelen uit met FSCA versus FSCH. Gate levende cellen met een levensvatbaarheidskleurstof om dode cellen uit te sluiten. Van levende enkele cellen worden verdeeld in CD33-negatieve lymfocyten en CD-33-positieve myeloïde cellen.

Binnen CD33-positieve cellen worden CD14-positieve monocyten geïdentificeerd. Vervolgens binnen CD33-positieve cellen identificeren we CD14-negatieve, CD11C-positieve dendritische cellen. Nu gaan CD33-negatieve lymfocyten CD3-positieve T-cellen en CD3-negatieve, CD56-positieve natuurlijke killercellen.

Binnen CD3-positieve T-cellen identificeer je CD8-positieve en CD4-positieve subsets en identificeer je CD3-negatieve, CD56-negatieve, CD19-positieve B-cellen. Om te beginnen ontdooi je een flesje met cryo-geconserveerde rode bloedcellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Breng de suspensie over in een 15-milliliter conische buis met 10 milliliter T-celmedia en centrifugeer op 430 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Gooi het supernatant weg. Na het opnieuw opsuspendelen van de celpellet met één milliliter PBS, voeg je nog eens negen milliliter PBS toe aan het monster. Centrifugeer de buis op 430 g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Tel de cellen en beoordeel de levensvatbaarheid met trypan blue exclusion. Als de levensvatbaarheid minder dan 70% is, gebruik dan een dode celverwijderingskit als volgt. Bereid eerst een 1x-bindende buffer voor door de 20x-binding bufferbouillon te verdunnen met steriel dubbel gedestilleerd water.

Suspendeer de celpellet opnieuw in 100 microliter dode celverwijderingsmicrokorrels per 10 tot de kracht van zeven cellen in totaal. Meng goed en laat het 15 minuten op kamertemperatuur incuberen. Plaats de magnetische scheidingskolom in de juiste magnetische standaard, samen met een verzamelbuis.

Vervolgens balanceren we de kolom door te spoelen met 500 microliter 1x-binding buffer. Breng het celophangingsvolume naar 500 microliter met 1x bindingsbuffer. Na het vervangen van de verzamelbuis breng je de celsuspensie aan op de kolom en vang je de doorstroming op in de nieuwe 1,7-milliliter microcentrifugebuis.

Vervolgens was je de kolom twee keer met 500 microliter bindingsbuffer en verzamel je de doorstroming in dezelfde microcentrifugebuis. Centrifugeer het eluaat op 300 g gedurende 10 minuten en gooi het supernatant weg. Tel de cellen en beoordeel de levensvatbaarheid opnieuw met trypan blue exclusion.

Aliquot 20.000 levensvatbare cellen in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Centrifugeer vervolgens de cellen op 300 g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Susselt de cellen opnieuw met 40 microliter PBS met 0,04% BSA.

Plaats tenslotte de buis met de cellen op ijs en stuur deze onmiddellijk naar een genomische kernfaciliteit voor bibliotheekgeneratie en sequencing. Verzamel de sequencingresultaten in het formaat van celranger-uitvoeren. Gedroogde bloedvlekmonsters van premature baby's en controles werden verwerkt.

En de genormaliseerde eiwitexpressie van 92 immuungerelateerde eiwitten werd gekwantificeerd. De expressie van lymfocytenactivatiegen drie en signaaldrempelregulerende transmembrane adapter 1 waren significant hoger in perifeer bloed van premature baby's op twee maanden leeftijd vergeleken met navelstrengbloed in termen. Er werd een uitgebreide gatingstrategie gebruikt om leukocytenpopulaties te identificeren uit rode bloedcellen gelyseerde witte bloedcelmonsters.

Binnen de T-celpopulatie werden CD4-positieve en CD8-positieve subsets onderscheiden. Na het filteren werden meer dan 120.000 cellen gevangen en geprofileerd in de single-cell ribonucleïnezuursequencingdataset. Dimensionaliteitsreductie en clusteringanalyse identificeerden 14 verschillende celclusters.

Celclusters werden geannoteerd op basis van differentieel tot expressie gebrachte genen en bekende celmarkers. 12 van de 14 clusters kwamen overeen met immuuncellijnen, waaronder T-cellen, natuurlijke killercellen, B-cellen, myeloïde cellen en neutrofielen. Een gestapelde staafdiagram illustreerde het relatieve aandeel cellen per cluster over een week, één maand en twee maanden leeftijd.

Deze studie maakt het mogelijk om cellulaire, transcriptomische, proteomische en functionele immuunsignaturen longitudinaal te meten uit bloedmonsters met een beperkt volume. Toekomstige studies kunnen deze methoden gebruiken om gezonde immuuntrajecten te definiëren en verstoorde immuunresponsen in het vroege leven te ontdekken die verband houden met ziekten.