Een techniek voor het stabiliseren van membraaneiwitten in nanodiscs

Dit protocol benadrukt een reproduceerbare nanodisc-reconstitutieworkflow met een framework voor gegenereerde methoden. Detergenten destabiliseren de membraaneiwitten. Nanodiscs met MSP's en lipiden nemen de natuurlijke structuur waar voor cryo-EM en lysis.

Begin met het toevoegen van de in chloroform bereide lipidecomponenten aan een glazen reageerbuis om een 100-microliter lipidenmengsel te bereiden en meng grondig. Verdamp de chloroform onder een zachte stroom stikstofgas totdat alle vloeistof is verwijderd. Voeg ongeveer twee milliliter n-pentaan druppelgewijs toe aan het glazen reageerbuisje en laat het oplosmiddel verdampen met stikstofgas om een droge, transparante lipidefilm te verkrijgen.

Na het losmaken van de buisdop plaats je de buis in de vacuümuitdroger. Ontruim de uitdrooger en houd deze onder vacuüm om eventuele resterende oplosmiddelen te verwijderen. Verwijder vervolgens de lipidefilm uit de vacuümdesiccator en voeg 250 microliter detergentvrije, zoutarme buffer toe om de lipidefilm te hydrateren, wat resulteert in een uiteindelijke lipidenconcentratie van 10 milligram per milliliter.

Na het opnieuw ophangen van het lipide, verdeel het gelijkmatig in vier glazen buizen. Sonicaer de suspenties totdat ze helder en transparant zijn, wat wijst op succesvolle liposoomvorming. Spoel vervolgens direct de kopruimte van elke buis door met stikstofgas en bewaar bij min 80 graden Celsius tot gebruik.

Na transformatie van E.coli BL21-cellen met het MSP1D1-plasmide, met een 7-histidine-tag en daaropvolgende kweekuitbreiding. Induceer MSP-expressie door IPTG toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,5 tot één millimolair. Ga daarna door met het cultiveren van de cellen op 16 graden Celsius gedurende 16 tot 20 uur met schudden.

Centrifugeer de bacteriecultuur op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en houd de celpellet vast. Daarna wordt de pellet opnieuw opgehangen uit één liter kweek in 100 tot 150 milliliter lysisbuffer.

Homogeniseer grondig totdat een uniforme suspensie zonder zichtbare klonten is bereikt. Gebruik vervolgens een gekoelde ultrasone celdisruptor om de bacterie op 35% vermogen te breken met cycli van pulsen van drie seconden, gevolgd door pauzes van zes seconden. Blijf soniceren totdat het lysaat helder en lichtbruin van kleur is.

Centrifugeer het lysaat op 30.000g gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant voor de volgende stappen. Na het incuberen van het supernatant met gebalanceerde nikkel-NTA-hars en het wassen om onzuiverheden te verwijderen, elueer je het doeleiwit met de eluatiebuffer en verzamel je de eluaatfracties. Blijf fracties verzamelen totdat de absorptie van het eluaat bij 280 nanometer onder de 0,01 daalt.

Vervolgens brengt het verzamelde eluaat over in de dialysebuis en dialyseert het tegen de dialysebuffer bij vier graden Celsius met voorzichtig roeren gedurende de nacht. Na dialyse concentreert u de oplossing met een ultrafiltratieapparaat om een uiteindelijke MSP-concentratie van twee tot vijf milligram per milliliter te verkrijgen. Weeg ongeveer 250 milligram bio-kralen in een centrifugebuis van 50 milliliter.

Voeg 25 tot 30 milliliter methanol toe aan de buis. Draai het mengsel grondig of laat het mengsel in het donker vortexen. Na het incuberen van de buis op vier graden Celsius gedurende 20 minuten, gooi je het supernatant voorzichtig weg en herhaal je de methanolspoeling nog twee keer.

Voer drie keer vergelijkbare wasbeurten uit met dubbel gedestilleerd water en voeg dan 25 tot 30 milliliter wasmiddelvrije, zoutarme buffer toe aan de kralen. Schud of draai de buis op een draaiende tafel om te mengen en te incuberen, zoals eerder is aangetoond. Gooi het supernatant weg en herhaal de laag-zoutbuffer evenwichtsstap drie keer om de kralen volledig te conditioneren.

Verdeel de geactiveerde bio-kralen gelijkmatig in drie microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter voor verder gebruik. Haal één aliquot van de vooraf voorbereide lipidevoorraad en ontdooi die. Centrifugeer onmiddellijk de buis op 7.000g gedurende vijf seconden bij vier graden Celsius om de inhoud op de bodem op te vangen.

Ultrasonicaer de lipidenvoorraad in een waterbad op 60% amplitude en controleer elke vijf tot tien minuten de helderheid en temperatuur om oververhitting te voorkomen. Ga door met sonicatie totdat de lipide helder en transparant is. Bereken de molaire hoeveelheid van het doelmembraaneiwit met behulp van de gepresenteerde vergelijking.

Vervolgens bereken je de benodigde volumes MSP- en lipidestockoplossingen op basis van een molaire stoichiometrische verhouding van doeleiwit tot MSP tot lipide van één tot vijf tot 250. Combineer de bijbehorende volumes lipide en MSP om een master mix van 300 microliter te bereiden en incubeer 10 minuten op ijs. Voeg vervolgens langzaam 50 microliter van het mengsel toe aan de geconcentreerde eiwitoplossing terwijl je voorzichtig pipetteert om homogeniteit te waarborgen.

Leg het mengsel daarna een uur op ijs en draai de tube voorzichtig om elke 15 minuten om om het goed te mengen. Neem nu één aliquot van de voorgeactiveerde bio-kralen en aspireer de resterende laag-zout buffer. Voeg de eiwitoplossing toe aan de kralen en broed een uur lang in het donker uit bij vier graden Celsius.

Centrifugeer het mengsel op 7.000g gedurende vijf seconden bij vier graden Celsius. Breng het supernatant zorgvuldig over naar een tweede aliquot van bio-kralen waaruit de laag-zoutbuffer is geaspireerd. Na het goed mengen van de inhoud door een zachte inversie, breng je vier tot acht uur of een nacht in het donker.

Zodra de eiwitoplossing kort is gecentrifugeerd, breng je de supernatant over naar de derde aliquot van voorgeactiveerde bio-kralen. Broed een uur lang met rotatie op vier graden Celsius in het donker. Na een korte centrifugatie brengt u het supernatant over in een schone microcentrifugebuis.

Centrifugeer op 17.000g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten om aggregaten te verwijderen. Na het zuiveren van de nanodisc TASK2-complexen met grootte-uitsluitingschromatografie, worden de piekfracties uit de elutie gebundeld en geconcentreerd tot een uiteindelijke nanodisc TASK2-concentratie van 1,2 tot 1,5 milligram per milliliter. Om de nanodiscassemblage te verifiëren, analyseer je de monsters met 12%SDS-PAGE en bevestig je de aanwezigheid van MSP en het doelmembraaneiwit.

Het grootte-uitsluitingschromatografieprofiel vertoonde twee hoofdpieken die overeenkwamen met het geassembleerde nanodisccomplex bij 15,1 milliliter en vrije MSP bij 18,0 milliliter. Kwantificering van piekgebieden toonde aan dat de geassembleerde nanodiscpiek een oppervlakte van 147,2 had. Daarentegen had de vrije MSP-piek een oppervlakte van 31,5, wat overeenkomt met een assemblage-efficiëntie van 82,4%. Comigratie van het doeleiwit en MSP in SDS-PAGE bevestigde hun opname in één nanodisccomplex.

Dit protocol helpt onderzoekers om de structuur van membraaneiwitten te bestuderen met behulp van de samenstelling van nanodisc-arrays. Het meest uitdagende is het optimaliseren van de verhouding tussen het membraaneiwit, MSP en de lipiden. Functionele assays, oppervlakteplasmonresonantie en massaspectrometrie kunnen ook met deze procedure worden uitgevoerd.