Een hypoxie-reoxygenatie-schademodel bij zelf-assemblerende menselijke cardioïden

Ons onderzoek richt zich op het vinden van nieuwe manieren om het hart te helpen regenereren na een blessure. Hiervoor genereren we zelfassemblerende hartorganoïden en voeren we hypoxie-reoxygenatiestudies uit. Dit protocol kan worden toegepast om letselrespons te bestuderen, therapeutische interventies ter bevordering van regeneratie en kan worden gebruikt voor patiëntspecifieke ziektemodellering.

Om te beginnen aspireer je het D1-media-cardiale mesoderm en voeg je voldoende celloskoppelingsoplossing toe om de door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartmesodermcellen volledig te bedekken. Plaats het bord vervolgens vijf minuten in een broedmachine op 37 graden Celsius. Voeg met een pipet een gelijk volume D2 hartmesoderm aan elke put toe en pipetteer voorzichtig op en neer om de hechtende cellen vrij te laten, en breng de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis.

Gebruik een centrifuge om de cellen drie minuten bij kamertemperatuur op 300G te pelleteren. Suspendeer de pellet opnieuw in één milliliter D2 cardiac mesoderm specificatiemedium met vijf micromolaire IWP-2 en 50 microgram per milliliter ascorbinezuur in RB minus. Meng 10 microliter trypanblauw met 10 microliter celsuspensie in een microbuis.

Tel de cellen met de voorkeursmethode en verdun de cellen tot een concentratie van 100.000 cellen per milliliter in D2 cardiac mesoderm specificatiemedia, aangevuld met twee micromolaire thiazovivine. Breng de celsuspensie over naar een geschikt formaat reagensreservoir. Vervolgens doseert u met een multikanaals pipet 100 microliter in elke put van een ultra-low attachment 96-well plaat om een uiteindelijke concentratie van 10.000 cellen per put te bereiken.

Draai de plaat op 500G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de vorming van menselijke hartorganoïden in suspensiecultuur te induceren. Let op de vorming van een grote, goed afgebakende celpellet in elke put. Als de pellet niet is begrensd, herhaal dan centrifugatie.

Na 24 uur bereid je 10 milliliter D3-medium voor met vijf micromolaire IWP-2 en 50 microgram ascorbinezuur per milliliter in RB min per plaat. Voeg met een multikanaals pipet 100 microliter D3-media toe aan elke put zonder bestaand medium te verwijderen. De volgende dag verwijder je 100 microliter D3-media uit elke put.

Om het aspiratierisico te minimaliseren, kantel je de plaat op een hoek van 45 graden en houd je een multikanaals pipet onder een hoek van 90 graden ten opzichte van de zijwand van de plaat. Plaats de pipet stevig op de wand van de put en aspireer langzaam. Na het verwijderen van het medium vervang je het door 100 microliter D4-medium met vijf micromolaire IWP-2 in RB minus.

Met een pipet van 1.000 microliter waarbij de punt is afgesneden, breng je de menselijke hartorganoïden over in een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Laat de organoïden naar de bodem van de buis zakken en verwijder voorzichtig het overtollige medium. Voeg fosfaatgeborde zoutoplossing toe om de organoïden één keer te wassen.

Wacht een paar seconden tot ze zijn gezonken en verwijder voorzichtig het overtollige PBS. Voeg vervolgens 4% paraformaldehyde toe om de organoïden te fixeren en plaats de tube 30 minuten op kamertemperatuur om fixatie mogelijk te maken. Vervolgens wordt het gewenste aantal vaste organoïden overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter.

Verwijder de fixatieve oplossing en was de organoïden met PBS die 0,1% Tween 20 bevat. Bereid de primaire antistofoplossing voor door het antilichaam te verdunnen tot de gewenste concentratie in kleuringsoplossing. Voeg met een pipet 50 tot 100 microliter van de primaire antistofoplossing toe aan elke microcentrifugebuis, zodat de organoïden volledig bedekt zijn.

Na de incubatie en daaropvolgende wasbeurten wordt het monster 24 uur lang incubeed met een secundair antilichaam verdund in kleuroplossing bij vier graden Celsius op een schudplatform. Na de incubatie voert u wasbeurten uit zoals eerder beschreven. Vervolgens brengt u met een gesneden pipettip de organoïden over op een positief geladen glazen glaasje.

Verwijder voorzichtig overtollige PBS met Tween 20 en voeg een paar druppels montagemateriaal toe om de organoïden te bedekken. Leg voorzichtig een dekmantel over de organoïden om ze plat te maken. Daarna wordt er fluorescentiemicroscopie uitgevoerd.

Na het een nacht incuberen van de vaste organoïden in 30% sucrose bij vier graden Celsius, breng ze over in een plastic mal en voeg een klein druppeltje optimale snijtemperatuurpasta toe aan de mal, net genoeg om de organoïden te bedekken. Met fijne pincet of een pipettip verplaats je de organoïden voorzichtig in de verbinding zodat ze niet samenklonteren en niet van de randen van de mal zijn. Plaats de organoïden zo dicht mogelijk bij de onderkant van de mal om het aantal aanwezig te zijn bij één cryosectie te maximaliseren.

Plaats de mal in een piepschuim koeler met een laag droogijs om de eerste laag van de optimale snijtemperatuur te bevriezen. Wacht een paar minuten tot de pasta hard is en verplaats de mal dan naar het aanrecht. Voeg extra pasta met optimale snijtemperatuur toe totdat de mal gevuld is.

Laat de eerste laag volledig smelten voordat je de mal terugbrengt naar droogijs om volledig in te vriezen. Na het bevroren bewaar je de mallen op min 80 graden Celsius of ga je over tot cryosectie om zes micrometer secties te verkrijgen. Met een pipet wordt vijf milliliter hypoxie-medium per 96-wells menselijke organoïde plaat in een celkweekkolf overgebracht.

Plaats de kolf in een hypoxiekamer en spoel de kamer drie minuten lang met anoxisch gas bestaande uit 5% kooldioxide en 95% stikstof. Plaats de kamer minstens een uur in een broedmachine op 37 graden Celsius voordat je hypoxie start. Met een multikanaals pipet verwijder je ongeveer 150 microliter media uit alle putten van de menselijke cardiale organoïde plaat.

Verwijder vervolgens met een 200 microliter pipet voorzichtig het resterende medium uit elke individuele put zonder de organoïden te verstoren. Voeg 50 microliter hypoxie-medium toe aan elke put. Plaats de organoïde plaat van het menselijk hart in de hypoxiekamer.

Spoel de kamer drie minuten lang met anoxisch gas dat bestaat uit 5% kooldioxide en 95% stikstof. Plaats de hypoxiekamer zes uur lang in een broedmachine op 37 graden Celsius. Om reoxygenatie te starten, verwijder je de menselijke hartorganoïden uit de hypoxiekamer.

Voeg met een multikanaals pipet 150 microliter voorverwarmde RB+media toe aan elke put. Plaats de plaat tenslotte in een broedmachine bij 37 graden Celsius en laat ten minste drie uur reoxygenatie toe voordat je stroomafwaarts assays uitvoert. Na zes uur hypoxie en 24 uur reperfusie was de activiteit van extracellulaire lactaatdehydrogenase significant verhoogd bij gewonde menselijke hartorganoïden vergeleken met niet-gewonde controles.

De met hypoxie behandelde cardiale organoïden vertoonden TUNEL-positieve cardiomyocytenkernen, en het percentage TUNEL-positieve cardiomyocytenkernen was significant hoger bij gewonde organoïden vergeleken met ongedeerde controles. Een tijdsafhankelijke toename van littekenvorming werd waargenomen met de toenemende duur van hypoxie voorafgaand aan de reoxygenatie. 24 uur na reperfusie klopte 69% van de niet-gewonde menselijke hartorganoïden, terwijl geen van de gewonde organoïden sloeg.

Ongedwonde menselijke hartorganoïden vertoonden gesynchroniseerde calciumtransiënten over vijf interessegebieden, met pieken die tegelijkertijd optraden en met vergelijkbare golfvormen. Gewonde menselijke hartorganoïden vertoonden geen gecoördineerde contracties en vertoonden in plaats daarvan onregelmatige spontane calciumtransiënten over interessegebieden. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om een myocardinfarct na te bootsen bij iPSC-afgeleide menselijke hartorganoïden.

De grootste technische uitdaging bij het waarborgen van reproduceerbare schade is het volledig verwijderen van bestaande media. Onze toekomstige studies zijn gericht op het identificeren van factoren die weefselregeneratie in menselijke cardiale organoïde modellen kunnen bevorderen.